一、培養(yǎng)法
二、熒光指示細胞法
熒光指示細胞法較為快捷,方法簡單,但其靈敏度有一定的欠缺, 易造成漏檢。
常見的支原體檢測方法中最簡單、最經濟的方法是熒光指示細胞法。該方法使用的熒光染料是煙酸己可堿,其激發(fā)波長為350nm(紫外激發(fā)),發(fā)射波長為420nm。該染料會結合到DNA 中富含A-T 的區(qū)域,由于支原體的DNA中A-T 含量占多數(55%~80%),所以可被染色而檢測到。支原體污染的細胞經染色后,在細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一的熒光小點,即為支原體DNA, 證明該細胞有支原體污染。
(一)材料與設備
1. 熒光顯微鏡。
2. CO2 培養(yǎng)箱。
3. 無菌小爬片。
4. 無菌培養(yǎng)皿。
5. 不含抗生素的完全培養(yǎng)液。
6. 二苯甲酰胺熒光染料濃縮液(50μg/ml) 。稱取5mg 二苯甲酰胺熒光染料加入100ml 不含酚紅和碳酸氫鈉的Hanks 平衡鹽溶液中,在室溫下用磁力攪拌30~40min, 使完全溶解,-20℃ 避光保存。
7. 二苯甲酰胺熒光染料工作液(0.5μg/ml) 。取1ml 上述濃縮液,加至100ml 無酚紅和碳酸氫鈉的Hanks 溶液中,終濃度為0.5μg/ml 。
8. 固定液,即乙酸:甲醇(1 : 3) 溶液為細胞固定液。
9. 封片液。0.1mol/L枸櫞酸22.2ml, 0.2mol/L Na2HPO4·12H2O 27.8ml, 丙三醇50.0ml,以上三者混勻,調pH 至5.5 。
10.不含酚紅和碳酸氫鈉的Hanks 平衡鹽溶液或PBS。經多種方法檢測確定為支原體陰性的VERO 細胞。
(二)操作步驟
1. 無菌收集待測細胞上清:懸浮細胞離心后取上清液。
2. VERO 細胞爬片:將小爬片無菌置于小培養(yǎng)皿內,滴加VERO 細胞懸液(細胞濃度約3×104 個/ml) 2~3ml, 置于CO2 培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h 使其貼壁。
3. 制備標本。向6 孔板內滴加待檢細胞上清液約1ml, 注意設立對照組(已證實的支原體陽性和陰性細胞上清液),培養(yǎng)48h 后( VERO 細胞匯合前)將細胞爬片從平皿中取出。
4. 漂洗—將細胞爬片置于培養(yǎng)皿中,用不含酚紅、NaHCO3 的Hanks 溶液(或PBS) 漂洗3次。
5. 固定—用乙酸:甲醇(1 : 3) 固定液固定 10 min 。
6. 漂洗—待固定液自然風干后用去離子水漂洗3 次。
7. 染色—置于Hoechst 33258 工作液(0.5μg/ml) 中染色10 min 。
8. 漂洗—去離子水中漂洗3 次,每次1 ~2min 。
9. 封片,紫外激發(fā),觀察。
(三)結果判斷
當陰性及陽性對照結果均成立時,結果有效 。
1. 陰性結果 僅見待檢細胞的細胞核呈現藍色熒光。
2. 陽性結果 熒光顯微鏡下細胞周圍或細胞膜表面可見大小不等、不規(guī)則的藍色熒光小點和絲狀點。
(四)小結
1. 嚴格配制工作液及封片液。
2. 保證作為指示細胞的VERO 細胞沒有被支原體污染。
3. 必須同時設立陽性及陰性對照, 注意重復,以排除假陽性和假陰性結果。4. 應全面觀察爬片,并注意可疑陽性的熒光點是凋亡小體還是支原體污染。
5. 可適當調整熒光染料的工作濃度和染色時間,避免出現非特異性染色,如胞漿著色。
三、PCR 法
5. 瓊脂糖凝膠電泳。PCR 反應結束后,進行瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖凝膠濃度為2%。電泳結束后,凝膠成像分析結果。6. 結果分析。該方法為檢測支原體的定性方法,在電泳泳道上, Marker、陽性對照、內對照均會出現不同的電泳條帶, 當被檢樣品泳道出現明亮條帶,且位置在陽性對照和內對照條帶位置之間,即可認為該樣品被支原體污染 。
有時還會發(fā)現一條泳道出現多條,可能是該樣品感染2 種以上支原體所致。如果泳道內條帶隱約出現,則可懷疑有支原體污染,重做該樣品。
(三)注意事項PCR 反應的前期操作應在無菌環(huán)境中進行。注意假陽性、假陰性,有時需多次重復。
四、掃描電子顯微鏡法
支原體感染會使培養(yǎng)細胞慢慢枯萎,因此對培養(yǎng)細胞定期進行支原體檢測非常重要。一般來說每1至3個月就應該進行一次支原體檢測。將定期支原體檢測常規(guī)化堅持下去,是細胞培養(yǎng)實驗室應對支原體感染的關鍵。