好想被狂躁无码视频国产_一区二区欧美日韩高清免费_国产伊人一区二区三区在线观看_孩交video另类视频_太粗啦太硬了受不了_国产真A级女人特级毛片_人妻无码中文专区久久五月婷丁香_免费无删减羞羞漫画在线看_日韩在线播放一二三区免费观看_国产天美传媒性色av

關于支原體檢測的幾種方法,你了解多少?


如何選擇正確的方法進行細胞的支原體檢測?支原體的檢測方法有哪些?目前實驗室常用的支原體檢測方法有培養(yǎng)法、熒光指示細胞法、PCR 法、掃描電子顯微鏡法,這些方法各有優(yōu)缺點。各實驗室可根據具體情況,選擇不同的方法,或幾種方法聯合使用。


一、培養(yǎng)法   

 


培養(yǎng)法為最為經濟可靠的方法,但其實驗周期較長,所以常用來進行對懷疑細胞的最后甄別。常用于細胞及臨床治療細胞的支原體檢查。


(一)材料與設備
1. 精氨酸肉湯培養(yǎng)基   按說明稱量粉劑,蒸餾水配制, 高壓除菌(加20%胎牛血清)。
2. 支原體瓊脂培養(yǎng)基   按說明稱量粉劑,蒸餾水配制,高壓除菌(加20%胎牛血清)。
3. 其他   超凈工作臺、無菌吸管、試管架、培養(yǎng)試管/皿、37°C 培養(yǎng)箱。


(二)操作步驟
1. 樣品的儲存。樣品取材后,最好盡快進行檢測。樣品如在24h 以內進行支原體檢測, 可儲存在2~8℃; 如果超過24h 樣品應放置于-20℃ 以下保存。-20℃保存的樣品,進行檢測時需重新加入到對照培養(yǎng)細胞中,培養(yǎng)72h 后,取上清直接進行接種檢測。
2. 準備精氨酸肉湯培養(yǎng)基、支原體瓊脂培養(yǎng)基(半流體)。
3. 將樣品分別接種到10ml 精氨酸肉湯培養(yǎng)基、半流體培養(yǎng)基中(已冷卻至36℃) ,每支培養(yǎng)基接種樣品0.5~ 1.0ml. 每種樣品接種6 支精氨酸肉湯培養(yǎng)基,3 支半流體培養(yǎng)基。
4. 接種6d 后,取3 支精氨酸肉湯培養(yǎng)基中樣品0.5 ~ 1.0ml. 復種于精氨酸肉湯培養(yǎng)基中。
5. 36 ℃ 培養(yǎng)29d, 每隔3d 觀察一次。記錄實驗結果。


(三)結果判斷
培養(yǎng)結束時,精氨酸肉湯培養(yǎng)基如有支原體生長,則液體顏色改變(粉色或黃色) 。
半流體培養(yǎng)基中如有支原體生長,則出現絮狀沉淀



二、熒光指示細胞法 

 

熒光指示細胞法較為快捷,方法簡單,但其靈敏度有一定的欠缺, 易造成漏檢。


常見的支原體檢測方法中最簡單、最經濟的方法是熒光指示細胞法。該方法使用的熒光染料是煙酸己可堿,其激發(fā)波長為350nm(紫外激發(fā)),發(fā)射波長為420nm。該染料會結合到DNA 中富含A-T 的區(qū)域,由于支原體的DNA中A-T 含量占多數(55%~80%),所以可被染色而檢測到。支原體污染的細胞經染色后,在細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一的熒光小點,即為支原體DNA, 證明該細胞有支原體污染。


(一)材料與設備

1. 熒光顯微鏡。
2. CO2 培養(yǎng)箱。
3. 無菌小爬片。
4. 無菌培養(yǎng)皿。
5. 不含抗生素的完全培養(yǎng)液。
6. 二苯甲酰胺熒光染料濃縮液(50μg/ml) 。稱取5mg 二苯甲酰胺熒光染料加入100ml 不含酚紅和碳酸氫鈉的Hanks 平衡鹽溶液中,在室溫下用磁力攪拌30~40min, 使完全溶解,-20℃ 避光保存。
7. 二苯甲酰胺熒光染料工作液(0.5μg/ml) 。取1ml 上述濃縮液,加至100ml 無酚紅和碳酸氫鈉的Hanks 溶液中,終濃度為0.5μg/ml 。
8. 固定液,即乙酸:甲醇(1 : 3) 溶液為細胞固定液。
9. 封片液。0.1mol/L枸櫞酸22.2ml, 0.2mol/L Na2HPO4·12H2O 27.8ml, 丙三醇50.0ml,以上三者混勻,調pH 至5.5 。
10.不含酚紅和碳酸氫鈉的Hanks 平衡鹽溶液或PBS。經多種方法檢測確定為支原體陰性的VERO 細胞。

(二)操作步驟
1. 無菌收集待測細胞上清:懸浮細胞離心后取上清液。
2. VERO 細胞爬片:將小爬片無菌置于小培養(yǎng)皿內,滴加VERO 細胞懸液(細胞濃度約3×104 個/ml) 2~3ml, 置于CO2 培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h 使其貼壁。
3. 制備標本。向6 孔板內滴加待檢細胞上清液約1ml, 注意設立對照組(已證實的支原體陽性和陰性細胞上清液),培養(yǎng)48h 后( VERO 細胞匯合前)將細胞爬片從平皿中取出。
4. 漂洗—將細胞爬片置于培養(yǎng)皿中,用不含酚紅、NaHCO3 的Hanks 溶液(或PBS) 漂洗3次。
5. 固定—用乙酸:甲醇(1 : 3) 固定液固定 10 min 。
6. 漂洗—待固定液自然風干后用去離子水漂洗3 次。
7. 染色—置于Hoechst 33258 工作液(0.5μg/ml) 中染色10 min 。
8. 漂洗—去離子水中漂洗3 次,每次1 ~2min 。
9. 封片,紫外激發(fā),觀察。


(三)結果判斷
當陰性及陽性對照結果均成立時,結果有效 。
1. 陰性結果 僅見待檢細胞的細胞核呈現藍色熒光。
2. 陽性結果 熒光顯微鏡下細胞周圍或細胞膜表面可見大小不等、不規(guī)則的藍色熒光小點和絲狀點。


(四)小結
1. 嚴格配制工作液及封片液。
2. 保證作為指示細胞的VERO 細胞沒有被支原體污染。
3. 必須同時設立陽性及陰性對照, 注意重復,以排除假陽性和假陰性結果。4. 應全面觀察爬片,并注意可疑陽性的熒光點是凋亡小體還是支原體污染。
5. 可適當調整熒光染料的工作濃度和染色時間,避免出現非特異性染色,如胞漿著色。



三、PCR 法  

 


PCR 法檢測支原體的方法最為快速、靈敏、取樣量少,既可做細胞本身,也可做細胞上清的檢測,同時可以檢測多種支原體的污染,是目前常用的檢測手段。但其成本較高,條件要求嚴格,且有時易出現假陽性或假陰性。彌補的方法是對懷疑的樣品要經過3 次PCR 檢測,或用培養(yǎng)法檢測。

PCR 法是20 世紀80 年代中期建立起來的一種體外DNA 擴增實驗,其基本原理是酶促DNA 合成反應,即在DNA 模板、引物和脫氧核糖核酸存在下,經DNA 聚合酶的作用,使DNA 鏈擴增延伸。該實驗具有靈敏度高、特異性強、檢測快速的特點,但其對實驗環(huán)境要求嚴格, 實驗成本較高, 有時還會出現假陽性的現象。


(一)材料與設備支原體
PCR 檢測試劑盒、dNTP 、TaqDNA 聚合酶、緩沖溶液、瓊脂糖、礦物油、超凈工作臺、PCR 儀、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、臺式離心機、旋渦混旋器等。


(二)操作步驟
1. 樣品的收集。待測細胞用無雙抗培養(yǎng)液培養(yǎng)7d,用無菌容器取上清液500μl ,4℃ 保存待測。
2. 模板的制作。在無菌的條件下, 取細胞培養(yǎng)上清1 00μl 于一無菌的0.5ml塑料離心管內,蓋好蓋子, 95 ℃ 水浴加熱5min 。
3. 打開蓋子,向管內加StrataClean Resin 10μl,蓋好蓋子,旋渦混懸器混合,離心5~ 10s, 吸取上清至一新的塑料離心管中,模板制作完畢, 4℃ 保存。
4. PCR 反應。反應體系的最適條件為10mmol/L Tris-HCI (pH 8.38), 50 mmol/L KCI, 1.5~ 2.5 mmol/L MgCl2,200 μmol/L dNTP, 2U Taq DNA 聚合酶,總反應體系為50μl , 反應用去離子水均需用紫外燈照射。
(1)在0.5ml 塑料離心管中加入35.2μl 去離子水及5μl 10 xTaq 反應緩沖溶液。
(2)依次加入下列成分:0.4μl dNTP (25mmol/L)、0.4μl Taq 酶(5U/μl ) 、2μl引物。
(3)加2μl 去離子水,總體積45μl 。
(4)加5μl 已制成的模板到反應體系中。
(5)陽性對照,內對照各5μl 加入到各自的反應體系中。
(6)取1支含有以上反應體系的離心管,加入5μl 去離子水作為陰性對照管。
(7)在反應體系中加入100μl 礦物油。
(8)PCR 程序見下表。


5. 瓊脂糖凝膠電泳。PCR 反應結束后,進行瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖凝膠濃度為2%。電泳結束后,凝膠成像分析結果。6. 結果分析。該方法為檢測支原體的定性方法,在電泳泳道上, Marker、陽性對照、內對照均會出現不同的電泳條帶, 當被檢樣品泳道出現明亮條帶,且位置在陽性對照和內對照條帶位置之間,即可認為該樣品被支原體污染 。
有時還會發(fā)現一條泳道出現多條,可能是該樣品感染2 種以上支原體所致。如果泳道內條帶隱約出現,則可懷疑有支原體污染,重做該樣品。


(三)注意事項PCR 反應的前期操作應在無菌環(huán)境中進行。注意假陽性、假陰性,有時需多次重復。 


四、掃描電子顯微鏡法 

 

掃描電子顯微鏡法:掃描電子顯微鏡法非常直觀、準確,對使用環(huán)境要求高,操作復雜,實驗周期較長,常作為樣品的最后定性檢測。

(一)原理
利用電子顯微鏡的超級放大功能, 直接觀察培養(yǎng)細胞中支原體污染情況。

(二)材料與設備
待檢測細胞, 0.05%胰蛋白酶/0.02%EDTA 、2.5%的戊二酸、1%鋨酸、0.1mol/L磷酸緩沖溶液( pH7.4 ) ,掃描電鏡及相關設備。


( 三)操作步驟
1. 將待檢測細胞傳代至貼有蓋玻片的培養(yǎng)皿中。
2. 37°C , CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h , 取出蓋玻片。
3. 以PBS 洗滌3 次。
4 . 以2 .5%戊二醛/PBS 固定15min , PBS 洗滌。
5 .以1%鋨酸固定30min, PBS 洗滌。
6 . 乙酸異戊酯脫水。
7. CO2 冰點干燥。
8. 噴金。
9 . 掃描電鏡觀察,照相。


(四)結果分析


支原體感染會使培養(yǎng)細胞慢慢枯萎,因此對培養(yǎng)細胞定期進行支原體檢測非常重要。一般來說每1至3個月就應該進行一次支原體檢測。將定期支原體檢測常規(guī)化堅持下去,是細胞培養(yǎng)實驗室應對支原體感染的關鍵。


上一篇:當新冠碰上流感:是“火上澆油”還是“水火不容”?
下一篇:CAIVD訪阜外醫(yī)院周洲教授:用心肌標志物對健康人預先實施危險分層可有效延緩心梗