《新冠病毒核酸10合1混采檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》于2020年8月17日發(fā)布，該規(guī)范中的10合1混采檢測(cè)（10-in-1 test）技術(shù)，是指將采集自10人的10支拭子集合于一個(gè)采集管中的方法。該規(guī)范的制定有效滿足了我國目前新型冠狀病毒疫情常態(tài)化防控需求，大幅提升了對(duì)低風(fēng)險(xiǎn)人群新冠病毒核酸檢測(cè)的能力和效率，對(duì)指導(dǎo)各地做好新冠病毒核酸混采檢測(cè)工作和應(yīng)對(duì)秋冬季新冠肺炎疫情有重大意義。

一、樣本采集耗材規(guī)格

該技術(shù)規(guī)范對(duì)采集管的材質(zhì)及外觀尺寸做了推薦，同時(shí)規(guī)定采集管容量企業(yè)定標(biāo)10ml。病毒采集管內(nèi)含帶有顏色指示劑、病毒滅活劑的保存液6ml，為單采管保存液3ml的2倍。保存液體積、成份及采集管尺寸的確定來源于前期基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果及實(shí)踐操作。

1. 保存液體積的倍增對(duì)弱陽性標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果無影響：本基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究前期對(duì)新冠病毒核酸中值質(zhì)控品（5000copies/ml）和臨界陽性質(zhì)控品（1000copies/ml）分別進(jìn)行1:2、1:3及1:4倍稀釋，以估計(jì)不同擴(kuò)增試劑對(duì)新冠病毒陽性和弱陽性樣本的檢出能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1:3以下稀釋濃度的樣本可以被準(zhǔn)確檢出。進(jìn)一步詳細(xì)評(píng)估了5種檢出限在500-1000copies/ml的試劑盒的性能指標(biāo)，其檢出限均滿足廠家使用說明書的標(biāo)準(zhǔn)。樣本采集管中保存液由3ml增加到6ml（1:2稀釋），其循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）增加1.0左右，符合理論推斷，對(duì)于弱陽性樣本的檢出能力幾乎沒有影響。

2. 采血管尺寸、保存液體積及成份的設(shè)置便于實(shí)驗(yàn)操作：（1）采集管外徑（14.8±0.2）mm，高度（100.5±0.4）mm，一方面采集管口徑與拭子3cm的斷點(diǎn)相匹配，拭子易于折斷，且不會(huì)引起液體外濺，保證采集人員生物安全；另一方面該規(guī)格的采集管加入6 ml保存液及10支拭子后，拭子不擁擠，管中保存液具有較好的流動(dòng)性，同時(shí)液面高度不超過管體高度的2/3，以上參數(shù)保證通過震蕩的方式可將拭子上的上皮細(xì)胞充分洗脫，并有足夠的液體用于檢測(cè)，同時(shí)合適的液面高度也避免了對(duì)移液器的污染以及開蓋時(shí)液體的迸濺。采集管蓋子松緊適度，既不能打開困難，也不能過于松弛造成漏液。（2）保存液應(yīng)當(dāng)帶有易于觀察、辨識(shí)的顏色。此推薦主要是便于PCR操作時(shí)微量加樣的準(zhǔn)確辨識(shí)，推薦使用酚紅作為指示劑。（3）保存液中應(yīng)帶有胍鹽或其他有效病毒滅活劑。病毒滅活成份推薦使用合適濃度的異硫氰酸胍。該物質(zhì)是強(qiáng)有力的蛋白質(zhì)變性劑，能迅速將蛋白質(zhì)與核酸分離，并且能夠破壞RNA酶的分子結(jié)構(gòu)，使樣本中可能存在的核酸酶失活，起到穩(wěn)定保存病毒核酸的作用。

3. 采集拭子宜選用聚酯、尼龍等非棉質(zhì)、非藻酸鈣材質(zhì)的植絨拭子。植絨拭子是將尼龍纖維經(jīng)專有的噴霧技術(shù)制成，與傳統(tǒng)纖維纏繞的拭子相比，能吸附更多的生物樣本并可達(dá)到較高的釋放率。棉質(zhì)材料容易攜帶抑制微生物存活的物質(zhì)，可能對(duì)病原體的檢出存在影響。采集拭子折斷點(diǎn)位于距拭子頭頂端3cm左右，與采集管直徑相匹配，利于折斷；過長的拭子頭會(huì)過多占用采集管內(nèi)的空間。

二、采集地點(diǎn)要求

選擇空曠、通風(fēng)良好的場(chǎng)地作為大規(guī)模人群篩查集中采集地點(diǎn)，并劃分為等候區(qū)、采集區(qū)、緩沖區(qū)和臨時(shí)隔離區(qū)，利于有效分散待檢人員密度。各區(qū)域根據(jù)天氣條件配備保溫、降溫，遮陽、遮雨等設(shè)施并配備急救設(shè)備。各區(qū)根據(jù)功能配備標(biāo)本采集、暫存、人員防護(hù)及戶外消殺設(shè)備與用品。受檢者按順序從等候區(qū)進(jìn)入采集區(qū)，人與人之間保持1米距離。臨時(shí)隔離區(qū)用于暫時(shí)隔離在采集過程中發(fā)現(xiàn)的疑似患者或高危人群。

三、采集流程

1. 標(biāo)識(shí)及信息登記：由于10合1混采檢測(cè)技術(shù)要將10個(gè)受檢者的標(biāo)本放入同一個(gè)標(biāo)本采集管中，系統(tǒng)詳細(xì)記錄被檢者信息，并保證標(biāo)本信息的可追溯性就顯得尤為重要。所以規(guī)范中要求工作人員在采集前先將10個(gè)受檢者編為一組，收集并登記受檢者相關(guān)信息（姓名、性別、身份證號(hào)、聯(lián)系電話、采集時(shí)間、地點(diǎn)等），并按照組別進(jìn)行采集管編號(hào)。最好使用身份證讀卡器、二維碼條碼等信息化手段關(guān)聯(lián)受檢者信息，保證信息讀取效率和準(zhǔn)確性。當(dāng)無信息化條件時(shí)，可以提前登記紙質(zhì)版《新冠病毒核酸10合1混采檢測(cè)登記表》。紙質(zhì)登記表隨標(biāo)本送檢前需要備份存檔于采集點(diǎn)所在社區(qū)，便于及時(shí)追溯受檢者。

2. 采集方法：規(guī)范中描述了目前篩查最常使用的口咽拭子標(biāo)本的采集方法。被采集人員頭部微仰，嘴張大，發(fā)“啊”音，露出兩側(cè)咽扁桃體，采集人員將拭子越過被采集人員舌根，在兩側(cè)咽扁桃體稍微用力來回擦拭至少3次，然后在咽后壁上下擦拭至少3次。操作完畢后，將拭子頭置入管中、拭子折斷點(diǎn)置于管口處，稍用力折斷使拭子頭落入采集管的液體中，棄去折斷后的拭子桿，旋緊管蓋，將采集管置于穩(wěn)定的置物架上。為避免交叉感染，規(guī)范中特殊強(qiáng)調(diào)每例采集后采集人員均應(yīng)進(jìn)行手消毒。

3. 混合拭子：依照上述采集方法依次采集其余9支拭子，將完成采集的拭子放入同一采集管中，動(dòng)作輕柔，避免氣溶膠產(chǎn)生。連續(xù)采集10支拭子以后，旋緊管蓋，防止溢灑。如采集管內(nèi)拭子不足10支，應(yīng)做好特殊標(biāo)記并記錄。

四、標(biāo)本送檢

首先需要核對(duì)采集管標(biāo)簽與混采登記表信息，確保準(zhǔn)確完整，編號(hào)一致。標(biāo)本按照A類感染性物質(zhì)進(jìn)行三層包裝，符合《危險(xiǎn)品航空安全運(yùn)輸技術(shù)細(xì)則》A類物品運(yùn)輸U(kuò)N2814標(biāo)準(zhǔn)。三層包裝分別為透明塑料密封袋（一層容器），內(nèi)配適量吸濕材料的包裝盒或雙層醫(yī)用垃圾袋（二層容器），和具有“生物危害”標(biāo)識(shí)的專用轉(zhuǎn)運(yùn)箱（三層容器），放入每層容器后需要密封，并用75%乙醇噴灑密封容器外部。其中二層容器和轉(zhuǎn)運(yùn)箱之間應(yīng)當(dāng)放置降溫凝膠冰袋以維持低溫保存環(huán)境，二層容器應(yīng)當(dāng)固定在轉(zhuǎn)運(yùn)箱中，保持標(biāo)本直立，防止溢灑。

標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)運(yùn)箱應(yīng)由專門人員負(fù)責(zé)運(yùn)送。標(biāo)本應(yīng)在采集后2-4小時(shí)內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。不能立即送檢的，應(yīng)配備專門冰箱或冷藏箱保存，并做好標(biāo)本接收、保存登記。標(biāo)本采集后24小時(shí)內(nèi)可置于4℃保存。但是，近來國外有學(xué)者研究證實(shí)使用UTM、UTM-RT、ESwab、M4等多種病毒轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基和生理鹽水保存標(biāo)本，即使在室溫儲(chǔ)存一周仍然可以擴(kuò)增出新型冠狀病毒RNA，短時(shí)間內(nèi)運(yùn)送標(biāo)本是否需要冷藏條件還有待進(jìn)一步研究。

五、實(shí)驗(yàn)室接收

運(yùn)送和接收人員應(yīng)當(dāng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行雙簽收。標(biāo)本接收時(shí)，除檢查混采登記表是否填寫完整，被檢者信息是否可追溯，還需檢查轉(zhuǎn)運(yùn)箱、二層容器有無破損。為保證操作人員安全，應(yīng)當(dāng)在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室核心區(qū)打開轉(zhuǎn)運(yùn)箱，取出二層容器。在生物安全柜中打開二層容器和最內(nèi)層密封袋，每層容器打開前，用75%乙醇噴灑或擦拭消毒，并檢查是否密封完好。使用后的二層容器內(nèi)外壁經(jīng)75%乙醇擦拭消毒后移出生物安全柜，并在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后使用紫外燈照射消毒。

取出采集管前需核對(duì)采集管標(biāo)簽與混采登記表信息是否一致，檢查管壁是否有破損、管口滲漏等，如無破損、滲漏，用75%乙醇噴灑或擦拭消毒。如有破損、滲漏，應(yīng)按標(biāo)本泄漏污染處理，用吸水紙覆蓋后使用0.55%含氯消毒劑進(jìn)行消毒處理，做好不合格登記后銷毀。

根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力評(píng)估，標(biāo)本如在24小時(shí)內(nèi)可完成檢測(cè)，置于4℃保存。否則標(biāo)本應(yīng)當(dāng)置于-70℃或以下溫度保存。如無-70℃保存條件，則于-20℃暫存。為提高陽性檢出率，應(yīng)避免標(biāo)本反復(fù)凍融，設(shè)立專庫或?qū)９癖４鏄?biāo)本，雙人雙鎖管理。

六、標(biāo)本檢測(cè)與質(zhì)量控制

1. 標(biāo)本檢測(cè)：由于混采標(biāo)本為10個(gè)拭子放在同一采集管中，相對(duì)空間狹小，檢測(cè)前必須進(jìn)行充分震蕩，保證所有拭子采集到的上皮細(xì)胞充分洗脫，之后再進(jìn)行核酸提取及擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。推薦選用包含針對(duì)新冠病毒開放讀碼框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核殼蛋白（nucleocapsidprotein，N）基因區(qū)域的試劑。依據(jù)我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，擴(kuò)增試劑盒建議選擇有國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)帶有注冊(cè)文號(hào)，檢測(cè)限低、靈敏度高的檢測(cè)試劑盒。

前期我們從參與研究的405名志愿者中，每人采集了2支咽拭子，1支置于含3ml保存液的常規(guī)病毒采集管（individual acquisition tube，IAT）中作為陰性對(duì)照，另一支放入10合1混采技術(shù)定制的含6ml保存液的病毒采集管（custom-made tube，CMT）中，9支來自不同志愿者的咽拭子為1個(gè)CMT。從45例SARS-CoV-2陽性患者中，每人采集2支咽拭子，1支放入IAT中，另1支放入含有9支陰性拭子的CMT中。所有IAT和CMT中的標(biāo)本在收集后24小時(shí)內(nèi)使用磁珠純化法提取RNA。利用廣州達(dá)安基因生物技術(shù)有限公司（中國廣州，檢出限500cp/ml）和武漢明德生物技術(shù)有限公司（中國武漢，檢出限500cp/ml）的試劑盒，分別對(duì)SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因片段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增儀器使用試劑盒推薦的Roche LightCycler 480（Roche，IN，USA），按照試劑盒說明書的建議設(shè)置擴(kuò)增條件為：50℃ 15min，95℃15min，45個(gè)循環(huán)的94℃ 3s，55℃ 45s（達(dá)安）；50℃ 15min，95℃ 3min，40個(gè)循環(huán)的95℃ 3s，60℃40s（明德）。記錄Ct值，并根據(jù)廠家說明書要求對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果表明采用CMT和IAT采集的陽性樣本，其檢測(cè)結(jié)果高度一致。

2. 檢測(cè)質(zhì)控及質(zhì)控結(jié)果：為保證核酸提取和實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增過程質(zhì)量，每批檢測(cè)均需要將質(zhì)控品隨機(jī)放在臨床標(biāo)本中，參與從提取到擴(kuò)增的全過程。其中至少需包括1份弱陽性質(zhì)控品，可監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室能否檢出低病毒載量標(biāo)本；2份陰性質(zhì)控品（試劑盒自帶陰性質(zhì)控品）和1份空白對(duì)照品（生理鹽水或焦碳酸二乙酯處理水），空白對(duì)照品應(yīng)當(dāng)開蓋放置在提取儀或操作臺(tái)面上過夜，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室是否存在標(biāo)本間的交叉污染及環(huán)境污染。弱陽性質(zhì)控品測(cè)定為陽性，陰性質(zhì)控品全部測(cè)定為陰性，視為在控。如失控，不可出具檢測(cè)報(bào)告，應(yīng)立即分析查找原因，必要時(shí)重新檢測(cè)標(biāo)本。

七、檢驗(yàn)結(jié)果處理

目前國家藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)的新冠核酸檢測(cè)產(chǎn)品大多數(shù)為熒光PCR法，其他還包括恒溫?cái)U(kuò)增芯片法、聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法等，因此新冠病毒核酸定性檢測(cè)報(bào)告應(yīng)當(dāng)包括檢測(cè)結(jié)果（檢出/陽性、未檢出/陰性）、方法學(xué)和檢出限等。依據(jù)所用擴(kuò)增試劑說明書，判斷檢測(cè)結(jié)果為未檢出/陰性或者檢出/陽性。為避免漏診，若結(jié)果處于灰區(qū)，建議作為混采陽性結(jié)果進(jìn)行復(fù)核。當(dāng)混采檢測(cè)結(jié)果為陽性、灰區(qū)或單個(gè)靶標(biāo)陽性時(shí)，應(yīng)通知相關(guān)部門對(duì)該混采管的10個(gè)受試者暫時(shí)單獨(dú)隔離，并重新采集單管拭子進(jìn)行復(fù)核。復(fù)核單管核酸檢測(cè)如均為陰性，則按照陰性結(jié)果回報(bào)。暫時(shí)隔離人員即解除隔離；如檢測(cè)結(jié)果為陽性，按程序上報(bào)。

八、檢測(cè)后標(biāo)本處理

檢測(cè)后的標(biāo)本應(yīng)當(dāng)盡快就地銷毀，按要求做好高壓滅菌質(zhì)量監(jiān)控和消毒、銷毀記錄。

九、技術(shù)人員基本要求

采集人員和檢測(cè)人員應(yīng)滿足《醫(yī)療機(jī)構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測(cè)工作手冊(cè)（試行）》要求。即采集人員需經(jīng)過生物安全培訓(xùn)且培訓(xùn)合格，熟悉標(biāo)本種類和采集方法，熟練掌握標(biāo)本采集操作流程及注意事項(xiàng)，同時(shí)做好標(biāo)本信息的記錄，確保標(biāo)本質(zhì)量符合要求，標(biāo)本及相關(guān)信息可追溯。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)具備相關(guān)專業(yè)的大專以上學(xué)歷或具有中級(jí)及以上專業(yè)技術(shù)職務(wù)任職資格，并有2年以上的實(shí)驗(yàn)室工作經(jīng)歷和基因檢驗(yàn)相關(guān)培訓(xùn)合格證書。工作人員數(shù)量應(yīng)當(dāng)與所開展檢測(cè)項(xiàng)目及標(biāo)本量相適宜，以保證標(biāo)本及時(shí)進(jìn)入檢測(cè)流程、及時(shí)匯報(bào)結(jié)果[8]。

十、生物安全防護(hù)

對(duì)于采集低風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域人群的采集者，可采用二級(jí)生物安全防護(hù)：一次性帽子、醫(yī)用防護(hù)口罩（N95）、手套（必要時(shí)雙層）、護(hù)目鏡/面屏、隔離衣，鞋套（必要時(shí)）。由于標(biāo)本箱在運(yùn)輸前已做消毒工作，因此標(biāo)本運(yùn)送人員采用一級(jí)生物安全防護(hù)即可，穿工作服，戴醫(yī)用外科口罩和乳膠手套，可戴醫(yī)用防護(hù)帽。

依據(jù)新型冠狀病毒的傳染途徑，標(biāo)本接收人員及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員，除處理標(biāo)本的人員必須嚴(yán)格遵照三級(jí)防護(hù)標(biāo)準(zhǔn)，其余人員可采用二級(jí)生物安全防護(hù)。生物安全三級(jí)防護(hù)包括醫(yī)用防護(hù)口罩或N95、單或雙層乳膠手套、面屏、護(hù)目鏡、工作服外防護(hù)服、單或雙層醫(yī)用防護(hù)帽，手衛(wèi)生。必要時(shí)雙層口罩（外醫(yī)用防護(hù)口罩，內(nèi)N95）。值得注意的是沒有必要超出此防護(hù)標(biāo)準(zhǔn)，過度防護(hù)不但會(huì)造成浪費(fèi)，還有增加感染的風(fēng)險(xiǎn)。

十一、相關(guān)定義

1.“中、高風(fēng)險(xiǎn)人群”：疫情發(fā)生時(shí)，居住或停留于當(dāng)?shù)卣畡澐值摹爸酗L(fēng)險(xiǎn)地區(qū)”和“高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)”人群。

2.“重點(diǎn)人群”：為密切接觸者、境外入境人員、發(fā)熱門診患者、新住院患者及陪護(hù)人員、醫(yī)療機(jī)構(gòu)工作人員、口岸檢疫和邊防檢查人員、監(jiān)所工作人員、社會(huì)福利養(yǎng)老機(jī)構(gòu)工作人員。

綜上所述，《新冠病毒核酸10合1混采檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》對(duì)新冠病毒核酸10合1混采檢測(cè)技術(shù)中的標(biāo)本采集耗材規(guī)格、采集地點(diǎn)、采集方法、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、人員和生物安全防護(hù)等方面做出了具體詳細(xì)的指導(dǎo)。該技術(shù)能夠顯著節(jié)省低風(fēng)險(xiǎn)人群大規(guī)模新冠病毒核酸篩查的成本，在保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的前提下，明顯提升新冠病毒核酸的檢測(cè)效率。在現(xiàn)有核酸檢測(cè)能力和條件下，為快速診斷新冠病毒感染和控制疫情傳播提供了理想策略。