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核酸檢測試劑生產(chǎn)及質(zhì)量控制

      核酸檢測試劑是基于核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)的體外診斷試劑,包括等溫擴(kuò)增、PCR,qPCR等。之前寫了一些診斷試劑的評價的內(nèi)容(診斷試劑評價系列2-核酸檢測方法(更正))。現(xiàn)在有些實驗室自己合成引物探針,生產(chǎn)qPCR診斷試劑,也有些試劑生產(chǎn)企業(yè)在問如何保證試劑生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制。檢測試劑的生產(chǎn)質(zhì)控與診斷試劑的評價既有相同點,因為都是基于相同的評價指標(biāo);又有不同點,生產(chǎn)過程會關(guān)注原料、半成品、成品,診斷試劑評價只針對成品。本章的很多內(nèi)容基于《核酸檢測試劑生產(chǎn)及質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》,但是這個原則缺乏可操作性,因此又進(jìn)行了擴(kuò)展和延伸,供大家參考。


一、原材料

1、dNTP

脫氧三磷酸核苷,核酸的組成成分,包括:dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP。應(yīng)為HPLC純、PCR級,無DNase和RNase污染。-20℃保存。

2、引物

由一定數(shù)量的核苷酸構(gòu)成的特定序列,通常采用DNA合成儀人工合成,合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化。

凍干粉,1800D以上。序列正確。純度應(yīng)達(dá)到電泳級(PAGE)或HPLC級,不含雜帶。應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明,如PAGE電泳結(jié)果或HPLC分析圖譜。

應(yīng)作HPLC分析和紫外光吸收分析。以紫外分光光度計測定OD260nm/OD280nm的比值在1.6~2.0之間,可視為合格引物。-20℃保存。

3、探針

是指特定的帶有示蹤物(標(biāo)記物)的已知核酸片段(寡聚核苷酸片段),能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交,用于特定核酸序列的探測。通常采用DNA合成儀人工合成,合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化,在5-端標(biāo)記熒光素報告基團(tuán)或其他發(fā)光標(biāo)記物,在3-端標(biāo)記熒光素淬滅基團(tuán),并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化。

凍干粉,90D以上。純度應(yīng)達(dá)到HPLC純,不含雜帶。應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明,如HPLC分析圖譜;應(yīng)對探針的核酸序列及標(biāo)記的熒光素或化學(xué)發(fā)光物進(jìn)行核實,并作HPLC分析。應(yīng)以可見—紫外分光光度計進(jìn)行200~800nm掃描,在260nm處應(yīng)有吸收峰。另外,根據(jù)標(biāo)記的熒光素的不同,還應(yīng)該在熒光素的激發(fā)波長處有吸收峰,如FAM熒光素在494nm、TET熒光素在521nm、TAMRA熒光素在560nm處有特異的吸收峰,雜交探針在493nm、625nm、685nm處有特異的吸收峰,檢定合格后入庫。避光、-20℃保存。

4、Taq DNA聚合酶

具有DNA聚合酶活性,無核酸外切酶活性及核酸內(nèi)切酶活性;具熱穩(wěn)定性,94℃保溫1小時后仍保持50%活性。-20℃保存。

5、UNG(尿嘧啶糖基化酶)

具有尿嘧啶糖基化酶活性,無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性,IU UNG在 37℃處理3分鐘后,103拷貝以下含U模版應(yīng)完全降解,不能產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。-20℃保存。

6、RT-PCR酶(反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增酶)

具逆轉(zhuǎn)錄酶活性和DNA聚合酶活性,無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性;具熱穩(wěn)定性,94℃1小時后仍保持50%活性,-20℃保存。


二、半成品與成品的質(zhì)控

半成品與成品的質(zhì)控基本上基于相同的評價指標(biāo),這里就合并在一起了。

1.精密度/重復(fù)性

指在同一實驗室使用相同方法進(jìn)行批內(nèi)與批間測量的一致性。

1.1樣品:

至少三個水平

①陰性樣本:待測物濃度低于最低檢測限或為零濃度

②臨界陽性樣本:待測物濃度略高于試劑盒的最低檢測限

③中/強(qiáng)陽性樣本:待測物濃度呈中度到強(qiáng)陽性

1.2評價指標(biāo):

①檢出率:陰性樣品和中/強(qiáng)陽性樣本檢出率為100%,臨界陽性樣本陽性檢出率應(yīng)≥95%。

②變異系數(shù):通常使用變異系數(shù)(CV)來評價重復(fù)性,一般要求CV≤10%,qPCR檢測試劑Ct值的CV≤5% 。

1.3批內(nèi)重復(fù)性:

同一批試劑,至少高/中,臨界和陰性3個水平的樣品,進(jìn)行3次以上重復(fù)。

1.4批間重復(fù)性:

至少3批試劑,至少高/中,臨界和陰性3個水平的樣品,不同的時間,經(jīng)不同的操作者,進(jìn)行至少20次的測定。


2.靈敏度/分析敏感性/最低檢測限

這里有2個指標(biāo)需要評價一個是最低檢測限,一個是線性。

2.1評價指標(biāo):

①使用相同基質(zhì)稀釋病原體、質(zhì)粒、假病毒等。

②最低檢測限:qPCR低于樣品中1000 copies/mL或10 copies/reaction。

在《2020年新型冠狀病毒核酸檢測室間質(zhì)量評價結(jié)果報告》中樣品設(shè)置的濃度最低為640 copies/mL,各廠家檢測結(jié)果如下圖。而各試劑廠家標(biāo)識的最低檢測限分別為:北京卓誠惠生(200)、華大生物(100)、上海伯杰(1000)、上海捷諾(500)、上海之江(1000)、圣湘生物(200)和中山達(dá)安(500)?!?000 copies/mL也是主流廠家普遍采用的最低檢測限,如果考慮到提取過程濃縮2-5倍和加模板量的2-5μL,換算為copies/reaction約為10.


③線性:R2>0.98,擴(kuò)增效率(90%-110%)

2.2最低檢測限

最低檢測限的評估應(yīng)該分2步進(jìn)行,首先選擇已知量值的模擬樣品(DNA病毒為質(zhì)?;蚣俨《?,RNA病毒為假病毒)或臨床樣品進(jìn)行倍比稀釋。

①使用梯度稀釋法,每個濃度梯度最少重復(fù)3次檢測,以100%可檢出的最低濃度水平作為估計檢測限。

②在此濃度附近制備若干梯度濃度樣品,每個濃度至少重復(fù)20次檢測,將具有90%~95%陽性檢出率的最低濃度水平作為確定的最低檢測限。

2.3線性

至少5個濃度,每個濃度至少3次重復(fù)。


3.分析特異性/交叉反應(yīng)

將樣品基質(zhì)中的目標(biāo)分析物與其他成分區(qū)分開的能力,如宿主DNA、血液組織等基質(zhì)。這部分內(nèi)容在PCR干擾實驗的設(shè)計思路 里做了詳盡的說明。

3.1非目標(biāo)微生物:其他非目標(biāo)微生物或其他非目標(biāo)亞型微生物。

3.2內(nèi)源性干擾物:

3.3外源性干擾物:

3.4常見干擾物建議試驗濃度:根據(jù)自身情況自己選擇。

4.符合率

測試臨床樣品的診斷敏感性和診斷特異性。


5.穩(wěn)定性

應(yīng)對需要進(jìn)行穩(wěn)定性考核的試劑成分,在特定溫度或條件下進(jìn)行穩(wěn)定性試驗。穩(wěn)定性試驗可采用加速破壞試驗。



三、質(zhì)量控制樣品盤

上述的指標(biāo)可以通過制備一個樣品盤同時對多指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)控。如下圖。



四、質(zhì)量控制圖

生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)量控制最常用的工具就是質(zhì)量控制圖。目前最廣泛使用的質(zhì)量控制圖是Levey-Jennings chart結(jié)合Westgard rules質(zhì)控規(guī)則。詳見使用質(zhì)量控制圖進(jìn)行實驗室的室內(nèi)質(zhì)量控制 。通過標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或者定值質(zhì)控品對每批次產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)控進(jìn)而繪制質(zhì)量控制圖可以更科學(xué)的評估每批次產(chǎn)品的質(zhì)量。


五、計量溯源性

在有國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或國家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品的情況下,診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)主動的將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品應(yīng)用到產(chǎn)品中,以保證診斷試劑可以溯源到準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品。

小結(jié):

實驗室自制的試劑由于缺乏嚴(yán)格的質(zhì)量控制,無法做到產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定可靠,本人是不認(rèn)同的。核酸檢測試劑生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)屬于每個企業(yè)的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn),可以使用最低標(biāo)準(zhǔn)也可以使用更嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)。這取決于每個企業(yè)對產(chǎn)品質(zhì)量的要求。我希望在中國的市場上大家追求的是“高質(zhì)高價”而不是“物美價廉”。


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