| 循環(huán)腫瘤細胞（CTC）是從原發(fā)性腫瘤部位“逃逸”到循環(huán)系統(tǒng)中，并隨著血液循環(huán)和淋巴循環(huán)“定居”到其他組織部位的細胞?！岸ň印钡腃TC可以在遠端器官中增殖，侵蝕正常組織。CTC可以認為是癌癥組織在人體內(nèi)散播的“癌癥種子”，這些“種子”的生根發(fā)芽引起的癌癥轉(zhuǎn)移是導至絕大多數(shù)與癌癥相關的死亡的重要原因。CTC的檢測分析可以幫助癌癥患者進行早期預后分析，確定癌癥的發(fā)展階段，并診斷性設計治療方案。與傳統(tǒng)的實體腫瘤組織活檢相比，CTC的檢測或液體活檢有兩個優(yōu)勢：01 CTC的檢測或活檢是非侵入性的。CTC的檢測或活檢只需采集患者的外周血樣本即可進行。驗血容易，安全，不容易受患者主觀意愿影響。02 CTC的檢測或活檢可以隨時間采集多個樣本，根據(jù)采集到的CTC反映的癌癥進展信息可以適當調(diào)整癌癥的治療方案。相對而言，對實體瘤的分析需要侵入性手術(shù)，采集樣本比較繁瑣，風險更大。但是另一方面，CTC在外周血中的數(shù)量非常稀少，通常每毫升血液中只有幾個細胞存在，這提高了CTC的檢測難度。此外，CTC的表面標記個體差異較大，這使得開發(fā)高靈敏度和特異度的檢測技術(shù)難度極大。 -1-
CTCs的檢測方法
免疫細胞化學
（immunocytochemistry，ICC） ICC利用抗原抗體結(jié)合的反應原理，首先使用單克隆抗體與特異性的腫瘤標志物反應，然后通過酶底物反應顯色來判斷腫瘤細胞的存在。CTC的標志物主要分為三類（1）上皮細胞角蛋白（CK），最常用的CK蛋白是CK19；（2）上皮細胞膜特異性抗原，最常見的是EpCAM；（3）腫瘤相關糖蛋白（TAG）。通常CTC的ICC特異性標志是EpCAM+CK+DAPI+CD45-；而白細胞的標志是EpCAM-CK-DAPI+CD45+。通過ICC可以將CTC從大量的淋巴細胞懸液中分離出來。ICC的優(yōu)點是能夠分離出CTC并保持細胞形態(tài)；然而由于CTC的異質(zhì)性，其細胞表面抗原不均一，導至ICC對CTC的檢測并不敏感。（flow cytometry，F(xiàn)CM）FCM同樣是利用抗原抗體結(jié)合的反應原理來篩選細胞的。流式細胞術(shù)可以將單克隆抗體制作稱為熒光探針，通過熒光探針與CTC的特異性表面抗原來標記CTC。通常使用的熒光抗體是EpCAM和CD45。FCM的優(yōu)點是可以在鑒定CTC的同時，檢測細胞形態(tài)和進行DNA倍數(shù)分析。其缺點是需要大量的血液樣本才能滿足FCM檢測的統(tǒng)計學要求，另外FCM檢測CTC同樣受制于CTC的表面特異性抗原的異質(zhì)性。RT-PCR的原理是利用逆轉(zhuǎn)錄酶將腫瘤特異性mRNA序列逆轉(zhuǎn)錄為DNA，然后通過PCR反應擴增特異性的DNA片段，從而檢測血液樣本中是否存在CTC特異性的mRNA。通常情況下，在CTC的特異性mRNA的選擇上主要有以下幾種途徑：（1）某些基因改變后RNA水平的異常表達，例如p53、ras的點突變，BRCA1、BRCA2的缺失突變，CD44產(chǎn)生異構(gòu)體、某些基因異常擴增（ERBB2，EGFR）等；（2）組織特異性標志的mRNA如mucin，cytokeratin，ER，maspin；（3）腫瘤特異性標志mRNA，如CEA，β-HCG等。RT-PCR的檢測CTC的優(yōu)點是靈敏度高、重復性好、價格低廉；其缺點是mRNA的表達具有不穩(wěn)定性、檢測過程必須破壞CTC、假陽性率高。-2-
CTCs的富集方法
通常CTC的大小、密度和電學特異與外周血的其他細胞有顯著的差異，通過這些差異可以設計出相應的CTC的分離方法。（1）利用CTC的大小和機械性能分離CTC，其主要原理是CTC的體積約在15-30μm，而普通的細胞的直徑在8-11μm的范圍內(nèi)，通過使用微孔濾膜、尺寸依賴的微流控芯片就可以將CTC從外周血中分離出來；（2）利用CTC的細胞密度的特異性，通過Ficoll密度梯度離心將CTC從單個核細胞中分離出來；（3）利用CTC的電學性能的特異性，通過電旋轉(zhuǎn)或者雙向電泳，可以將CTC從外周血分離出來。這種方法捕獲的CTC能夠保持較高的捕獲效率，并且保持細胞的活性。CTC具有特異性的表面marker分子，通過這些特殊的marker設計分離磁珠，可以同時對CTC進行分離和檢測。免疫磁珠分選CTC主要有直接捕獲的陽性富集法和去除其他細胞的陰性福激發(fā)。其主要原理是針對CTC表面主要表達的上皮細胞黏附分子（如：EpCAM）、細胞角蛋白（如：CK19）和腫瘤特異性抗原（如：HER2）使用交聯(lián)特異性抗體的免疫磁珠從外周血中捕獲CTCs。最典型的是Cell Search系統(tǒng)，利用免疫磁珠捕獲細胞，在使用FCM和ICC對細胞進行鑒定和計數(shù)。這種方法的優(yōu)點是方便、有效、分離的CTC純度高，并且能保持細胞活性。其缺點是價格昂貴、檢測敏感性受CTC表面抗原表達的制約，并且CTC經(jīng)過EMT后，其EpCAM等分子會丟失。-3-
CTC的臨床意義 體外早期診斷：通常的腫瘤的影像學診斷在癌癥的初期很難診斷出來。但是循環(huán)腫瘤細胞可以在癌癥的早期即可在血液中檢測到。因此循環(huán)腫瘤細胞可以作為癌癥早期篩查比較有潛力的指標。根據(jù)循環(huán)腫瘤細胞個數(shù)進行患者預后生存時間：大量的研究表明，循環(huán)腫瘤細胞可以作為癌癥預后生存時間的有效指標，其靈敏度要高于常見的影像學診斷。癌癥治療的療效評估：通常情況下，癌癥病人在接受癌癥治療后（放療、化療、免疫治療）的三個月后評估癌癥患者的治療效果。通過CTC檢測可以在治療后的幾周內(nèi)反應癌癥患者的腫瘤狀況，這樣可以及時地對癌癥療法進行評估和反饋，從而針對性地盡快進行下一步的治療方案的設計。-4-
CTC的研究現(xiàn)狀 2004年發(fā)表在新英格蘭上的一項多中心研究中[1]，研究者對177例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的循環(huán)腫瘤細胞水平進行了測試。實驗組中循環(huán)腫瘤細胞水平等于或高于每7.5 ml全血5的患者，與每7.5 ml全血中腫瘤細胞少于5的組相比，其中位無進展生存期更短（2.7 個月vs. 7.0個月，P <0.001）且總生存期也更短（10.1個月vs.> 18個月，P <0.001）。在開始治療后的首次隨訪中，兩組之間的這種差異持續(xù)存在（無進展生存期：2.1個月vs. 7.0個月，P <0.001；總生存期：8.2個月vs.> 18個月，P <0.001 ），且預后不良的患者比例從49％降低到30％，表明治療有益處。多元Cox比例風險回歸表明，在統(tǒng)計模型中的所有變量中，基線和首次隨訪時循環(huán)腫瘤細胞的水平是無進展生存期和總生存期的最重要預測指標。轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者治療前CTC水平是有效的預后預測因子。CTC計數(shù)小于5的患者無進展生存期(PFS)和總生存期(OS)均顯著高于CTC計數(shù)大于等于5的患者(Figure 1)。△Figure 1 Kaplan-Meier Estimates of Probabilities of Progression-free Survival and Overall Survival in Patients with Metastatic Breast Cancer for Those with <5 Circulating Tumor Cells per7.5 ml of Whole Blood and Those in the Group with ≥5 Circulating Tumor Cells per 7.5 ml of Whole Blood before Initiation of a NewLine of Therapy.2008年發(fā)表在J Clin Oncol.的一項研究[2]根據(jù)CTC水平分為CTC數(shù)量大于3個（7.5ml全血）的不良預后組和少于3個（7.5ml全血）的有利預后組。與基線CTC較差的患者相比，中位無進展生存期（PFS；4.5 v 7.9個月，P = .0002）和總體生存期（OS；9.4 v 18.5個月，P <.0001）較短。治療后1、2、3、5、6至12和13至20周持續(xù)存在差異。與在兩個時間點均具有不良CTC的患者相比，基線不良CTC在3至5周轉(zhuǎn)換為有利的PFS和OS顯著更長（PFS，6.2 v 1.6個月，P = .02；OS，11.0 v 3.7個月，P = .0002）。在非進展性患者中，影像學檢查后1個月內(nèi)CTC較不良CTCs生存時間更長（18.8 v 7.1個月，P <0.0001）。調(diào)整臨床重要因素后，基線和后續(xù)CTC水平仍是PFS和OS的有力預測指標(Figure 2)。
△Figure 2 (A) Overall survival in metastatic colorectal cancer patients by imaging response,(B) circulating tumor cell (CTC) yield within±1 month of imaging, and (C) both imaging response and circulating tumor cell yield within ±1 month of imaging. Overall survival (OS) values were calculated from the time of the baseline blood draws. PR, partial response; CR, complete response; S, stable disease; PD, progressive disease; FU, follow-up.2011年發(fā)表在J Clin Oncol.的一項針對非小細胞肺癌（NSCLC）的循環(huán)腫瘤細胞的研究中[3]，研究者對101例未接受過治療的III期或IV期NSCLC患者進行了標準治療前后的CTC分析。結(jié)果表明IV期NSCLC患者（n = 60;CTC數(shù)量范圍從0至146）的7.5 mL血液中的CTC數(shù)量高于IIIB期（n = 27; CTC數(shù)量范圍從0至3）或IIIA期疾?。╪ = 14；未檢測到CTC）。在單變量分析中，少于5個CTC的患者與化療前5個或更多CTC的患者的無進展生存期為6.8 v 2.4個月，P <.001，而總生存期（OS）為8.1 v 4.3個月，P <.001。在多變量分析中，CTC數(shù)量是OS的最強預測指標（危險比[HR]為7.92；95％CI為2.85至22.01；P<.001），并且通過在一個化療周期后采集的第二個CTC樣本，可以增加HR的點估計值（HR=15.65；95％CI，3.63~67.53；P <.001）（Figure 3）。△Figure 3 Kaplan-Meier curves for (A, C) progression-free survival (PFS) and (B, D) overall survival (OS) of patients with < five and ≥ five circulating tumor cells (CTCs) in 7.5 mL of blood at baseline, including (A, B) analysis of all patients (N = 101) and (C, D) analysis of patients with stage IV disease only (n = 60).M.Cristofanilli, G.T. Budd, M.J. Ellis, A.T. Stopeck, J. Matera, M.C. Miller,J.M. Reuben, G.V. Doyle, W.J. Allard, L.W.M.M. Terstappen, Circulating tumorcells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer, The NewEngland Journal of Medicine, 351 (2004) 781-791. S.J. Cohen, C.J.A. Punt, N.Iannotti, B.H. Saidman, K.D. Sabbath, N.Y. Gabrail, J. Picus, M.A. Morse, E.P.Mitchell, M.C. Miller, Relationship of Circulating Tumor Cells to TumorResponse, Progression-Free Survival, and Overall Survival in Patients WithMetastatic Colorectal Cancer, Journal of Clinical Oncology, 26 (2008)3213-3221. M.G. Krebs, R. Sloane, L.Priest, L. Lancashire, J.-M. Hou, A. Greystoke, T.H. Ward, R. Ferraldeschi, A.Hughes, G. Clack, M. Ranson, C. Dive, F.H. Blackhall, Evaluation and PrognosticSignificance of Circulating Tumor Cells in Patients With Non–Small-Cell LungCancer, Journal of Clinical Oncology, 29 (2011) 1556-1563.
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