近日，由中國抗癌協(xié)會腫瘤標(biāo)志專業(yè)委員會組織，重慶市中醫(yī)院輦偉奇教授、天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院于津浦教授、華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院袁響林教授、重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院張海偉教授擔(dān)任編寫組長，全國醫(yī)院和行業(yè)知名企業(yè)專家共計五十余人參與籌備和撰寫的《ctDNA高通量測序臨床實踐專家共識》（2022年版），正式刊登于《中國癌癥防治雜志》，鼎晶生物醫(yī)學(xué)總監(jiān)夏超然博士參與了本共識的編寫工作。共識的主要內(nèi)容包括：ctDNA定義概述，臨床應(yīng)用，檢測標(biāo)準(zhǔn)三部分內(nèi)容。
圖1. c t D N A 高 通 量 測 序 臨 床 實 踐 專 家 共 識(2 0 2 2 年 版)
ctDNA(circulating tumor DNA，ctDNA) 通常由腫瘤細胞主動分泌或在腫瘤細胞凋亡或壞死過程中釋放入循環(huán)系統(tǒng)中的DNA片段，長度132~145bp，半衰期較短(一般<2h)。因其無創(chuàng)或微創(chuàng)、檢測時間短、能夠反映瘤內(nèi)和轉(zhuǎn)移灶異質(zhì)性、可動態(tài)監(jiān)測治療療效等優(yōu)勢而在臨床得到越來越廣泛的應(yīng)用。ctDNA會攜帶來源于腫瘤細胞相關(guān)的遺傳學(xué)特征，如基因突變、甲基化、擴增或重排等，可作為腫瘤篩查、伴隨診斷、治療療效評估及預(yù)后風(fēng)險分層的重要指標(biāo)。然而，其豐度受多種因素影響，波動較大，在內(nèi)外因素特別是治療壓力下，其攜帶的生物信息可能會發(fā)生演變，且受正常細胞胚系變異或克隆性造血細胞體系突變干擾，在臨床檢測和報告解讀過程中應(yīng)特別注意。
ctDNA NGS檢測的臨床應(yīng)用
01
伴隨診斷
目前已有臨床證據(jù)支持ctDNA NGS檢測可應(yīng)用于肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等晚期實體腫瘤的伴隨診斷,但涉及的驅(qū)動基因及其變異類型與相應(yīng)分析體系均有嚴(yán)格限定,若超適應(yīng)癥應(yīng)用時,建議與患者就檢測必要性、檢測費用以及局限性等內(nèi)容進行充分知情。ctDNA NGS檢測已被國內(nèi)外專家共識或指南建議作為多種晚期惡性腫瘤（包含如胃食管腺癌 、NSCLC 、乳腺癌、轉(zhuǎn)移性胰腺癌、皮膚性黑色素瘤等 ）組織基因檢測的替代方式，但依據(jù)其分析結(jié)果實時制定臨床治療策略時仍需高級別循證證據(jù)支持。
02
評估腫瘤治療療效及預(yù)后風(fēng)險分層
采用腫瘤標(biāo)志物和影像學(xué)等傳統(tǒng)方法評估分子靶向和免疫檢查點抑制劑治療療效時,無法動態(tài)反映腫瘤特征性的分子演化,ctDNA NGS檢測可對腫瘤驅(qū)動基因相關(guān)ctDNA的豐度變化進行監(jiān)測,判斷腫瘤治療應(yīng)答,其有望成為新興的療效評估途徑。
微小殘留病灶(minimal residual disease,MRD)概念最早來自血液腫瘤。實體腫瘤的 MRD 概念更多被稱為分子殘留病灶(molecular residual disease,MRD)，是指經(jīng)過治療后，傳統(tǒng)影像學(xué)(包括 PET/CT)或其他實驗室方法不能發(fā)現(xiàn)，但通過液體活檢發(fā)現(xiàn)的腫瘤來源分子異常，代表腫瘤持續(xù)存在和臨床進展可能.ctDNA是評估MRD的一種非侵入性工具?，F(xiàn)已有多項研究表明術(shù)后ct DNA陽性與疾病復(fù)發(fā)之間的強相關(guān)性，術(shù)后的ctDNA分析結(jié)果可作為預(yù)后預(yù)測依據(jù)。ctDNA MRD檢測是全新的個性化技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，尚難以建立通用性技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，亟待通過大樣本、多中心、前瞻性的臨床試驗驗證其臨床效用。
03
助于腫瘤獲得性耐藥機制分析
在臨床環(huán)境中，ctDNA NGS檢測可用于識別分子靶向治療的耐藥機制，尤其對于疑難復(fù)雜的腫瘤患者，該結(jié)果有助于后續(xù)的治療選擇決策。免疫檢查點抑制劑治療獲得性耐藥機制復(fù)雜，治療選擇壓力下的腫瘤亞克隆演進僅為其部分原因，ctDNA靶向測序、全外顯子和 (或)全基因組檢測僅作為其轉(zhuǎn)化研究工具之一。
ctDNA NGS檢測標(biāo)準(zhǔn)
ctDNA NGS檢測的建立與優(yōu)化涉及分析前、分析中以及分析后的三個階段多個步驟，實驗室質(zhì)量管理需貫穿 ctDNA NGS檢測的整個流程。收集、樣本處理和自動化過程應(yīng)按照標(biāo)準(zhǔn)化和臨床驗證程序進行，最大程度防范因操作差異而引發(fā)的假陰性可能。樣本采集建議采用含細胞穩(wěn)定劑的抗凝管（如Streck采血管等游離核酸專用采血管）盡快完成血漿分離，提取的 cfDNA建議在24h內(nèi)進行后續(xù)檢測，否則，置于-30°C至-15°C下儲存并避免反復(fù)凍融。ctDNA NGS檢測應(yīng)根據(jù)項目需求選擇技術(shù)路線，可依據(jù)檢測基因數(shù)量及覆蓋范圍大小選擇不同測序策略。在進行基于 ctDNA的超高靈敏度突變檢測時，建議使用分子標(biāo)簽技術(shù)和優(yōu)化對應(yīng)的生物信息分析設(shè)置，以降低由于測序平臺隨機誤差導(dǎo)致的假陽性結(jié)果;建議通過建立測序噪音和克隆性造血背景庫的方法降低克隆性造血及背景噪音帶來的影響。
ctDNA NGS臨床檢測報告應(yīng)包含受檢者基本信息、樣本信息、實驗室信息、檢測項目、檢測結(jié)果及變異解讀、檢測方法的實驗室內(nèi)部驗證結(jié)果、檢測局限性及不確定性以及進一步檢測的建議等內(nèi)容。實驗室應(yīng)建立報告 SOP，建議根據(jù)國內(nèi)外文獻、共識指南、臨床試驗證據(jù)和實踐對檢出的腫瘤基因突變進行分類或分級報告。
臨床研究表明，基于ctDNA NGS檢測的bMSI(blood MSI)和bTMB (blood TMB)具有免疫檢查點抑制劑療效預(yù)測價值，但仍有諸多因素影響其在臨床中的應(yīng)用，如樣本采集時間、檢測panel基因覆蓋范圍、panel 大小、測序深度、生信算法及閾值設(shè)定等，未來還需開展更多的前瞻性臨床研究。機器學(xué)習(xí)等人工智能算法不僅能降低假陽性、提高靈敏度，還能有效整合多維度的異質(zhì)信息進行全面分析，大幅提高ctDNA數(shù)據(jù)效力，是ctDNA數(shù)據(jù)分析的主要方向。
本文編輯：Peng