《mNGS共識》近日發(fā)表在中華檢驗醫(yī)學雜志，該共識匯集了全國六十多位臨床和實驗室的專家，包括了感染、呼吸、重癥、微生物學等多個學科。今天因為時間的關系，我們請了三位主要的執(zhí)筆者作為主講，當然還有其他的撰寫者，我們也一并致謝。

mNGS由于技術有難度，臨床的適應癥、結果解讀方面不少同仁都存在困惑或質(zhì)疑，因此我們組織這場《mNGS共識》解讀活動，同大家一起分享和討論。我們非常榮幸地請到了一位重量級的專家陳佰義教授，和我一起來主持。

國內(nèi)近五年，mNGS技術有大規(guī)模應用，但沒有標準化，有的有誤導，國際上也沒有國內(nèi)應用的這么廣，面對二者的反差，王輝教授想牽頭從質(zhì)量角度，獲得共識、給出建議，初稿題目《宏基因組高通量測序技術應用于感染性疾病病原檢測的質(zhì)量管理規(guī)范中國專家共識》，后來落實審稿專家建議，改為現(xiàn)名《mNGS共識》。該共識由三個學組;中華醫(yī)學會檢驗醫(yī)學分會臨床微生物學組、中華醫(yī)學會微生物學和免疫學分會臨床微生物學組、中國醫(yī)療保健國際交流促進會臨床微生物與感染分會多個專家評議，歷經(jīng)7稿修改終成共識，最終發(fā)布于中華檢驗醫(yī)學雜志。

該共識王輝教授總負責、定稿、發(fā)起評議、通訊作者總負責，各位專家進行總的質(zhì)量把關和評議，這里面每一個推薦的字斟句酌，都滲透著多個專家背后的汗水。尹玉瑤老師負責術語、投稿；我負責適應征、專家評議、直播宣傳；陳宏彬老師負責標本、分析中環(huán)節(jié)；魯炳懷老師負責解釋、分析后環(huán)節(jié)、公眾號宣傳涉及到的編寫組的成員是多達68位，杜斌教授也參與了，但是杜斌教授后來沒署名，我們在致謝里向杜斌教授致敬，向各位專家致敬。

宏基因組高通量測序技術總的指導思想是沒有禁忌和明顯不合理的情況下，從寬。從臨床角度，這是明天的技術。不是今天的技術。定義明天，一定是從寬。目前沒有國家和地區(qū)（包括中國國家藥品監(jiān)督管理局、FDA、歐洲藥品監(jiān)督管理局）正式批準mNGS用于臨床感染性疾病的病原診斷。所有mNGS結果原則上都需要其他方法驗證。

臨床適應征部分2-7是6種情況：發(fā)熱、危重、免疫受損、局部、疑似感染治療無效、慢性??；8是不反對大撒網(wǎng)，反對的是無條件普遍進行的大撒網(wǎng)；8強調(diào)會診，其他文獻也有這一條建議。

耐藥性的分子生物學檢測包括PCR、探針/芯片、mNGS，耐藥性的分子生物學檢測（指PCR方法為主的核酸擴增方式）于2019年正式寫入CLSI M100文件。mNGS耐藥性檢測結果難以解釋，尤其是檢測標本采集自正常情況下就有微生物定植或污染的部位。mNGS的耐藥性檢測適應征見共識14、15。流病和感控適應征：出現(xiàn)某種疾病的聚集性疾病或暴發(fā)，懷疑是微生物導至的感染性疾病但病原不明，且常規(guī)快速檢測無結果時，建議完善常規(guī)檢測的同時或在其基礎上開展mNGS明確致病微生物，見共識16、17。

國際上目前有設備指南，有技術指南，但沒有專門的臨床實踐指南，沒有專家共識和其他臨床實踐指南。國內(nèi)沒有專門的指南，目前已有6個共識，大家也可以對照、參考。

最后特別向我們的幾個學會學組致敬，向我們參與這次共識撰寫的各位專家致敬，特別感謝中華檢驗醫(yī)學雜志，希望大家提出意見和建議，謝謝大家。

我們復習幾個重要術語, 宏基因組高通量測序（mNGS）：m指宏基因組（metagenome），是標本中全部生物（人、微生物）基因組的總稱。mNGS指對標本中的全部生物基因組進行測序。我們還應該掌握微生物組（Microbiome）、試劑盒基因（Kitome）、游離脫氧核糖核酸（cfDNA）、讀長（Reads）或稱序列數(shù)、比對(Alignment)、文庫（Library)、深度、覆蓋率、相對深度、Q值。Q值我們通?？碤30，它是指99.9%的準確率。

我們規(guī)范標本采集之后，不需要進行培養(yǎng)，直接提取標本里的核酸（DNA或RNA），如果提取DNA可能除了有微生物的核酸之外，還有相當一部分是人的核酸。之后建庫，包括片段化、加一些測序接頭等過程，隨后上芯片、測序、分析，形成最終報告。

除了 NGS之外，還有靶向測序，如果大家做過菌群分析的，比如腸道菌群或者呼吸道菌群分析，可能對這個就非常清楚，如果你要做細菌，這時候你們就做16SV3V4區(qū)或23SRNA的測序，然后再進行高通量測序，如果說要做真菌，然后我們做18S、21S或ITs1，然后再進行高通量的測序，這是靶向測序。

測序后要進行生物信息學分析，去除低質(zhì)量、低復雜度的序列和接頭去掉，去掉人的序列，得到物種信息，檢測耐藥基因毒力基因等。不同的NGS測序平臺有各自的優(yōu)缺點。

1、注意標本采集：嚴格無菌操作，避免污染；無菌、無核酸容器留取標本；mNGS RNA-seq：添加核酸穩(wěn)定劑；快速送檢，如不能快速送檢，保存于低于-70℃冰箱或液氮（血液標本應分離血漿后保存）。見共識18.

2、mNGS-DNA/RNA提?。翰煌噭┖袑Σ煌≡w的提取效能不同；高宿主背景標本需要去除宿主核酸，但去宿主核酸要小心，它是雙刃劍，它對微生物核酸也有影響，降低敏感性；同時注意部分污染可能來自核酸提取試劑盒。見共識19.

3、mNGS-建庫和測序：建庫慎用各種擴增方法，因為擴增會使正常菌群或污染病原體的序列擴大，難以判斷真正病原體；同時注意測序原始數(shù)據(jù)應進行質(zhì)控，并且過濾掉低復雜度、低質(zhì)量的序列，不同測序平臺，錯誤讀取堿基的概率不同，進行RNA測序比DNA測序更有益，但更耗時。見共識20.

4、mNGS-生信分析：mNGS最大的瓶頸是污染導至假陽性，要特別注意污染問題，我們推薦一些解決策略：根據(jù)臨床微生物專家和臨床醫(yī)生的指導添加解釋性注釋，使用替代方法確認由mNGS新鑒定的物種；實施污染監(jiān)測策略，例如專用的污染參考數(shù)據(jù)庫；設置陰性對照；臨床微生物和?？漆t(yī)師（臨床微生物測序委員會）結合臨床實際與主管醫(yī)師討論檢測結果。見共識23.

5、注意測序深度對結果的影響（共識24）和疑似背景微生物對mNGS的影響，如背景庫中微生物具有臨床意義，報告時需更高的報告閾值（共識25），而mNGS病原診斷閾值的設定依據(jù)實驗流程、生信分析流程不同，病原診斷閾值不同，亦因為不同標本類型、不同病原體的診斷閾值可能不同。（共識26）

6、數(shù)據(jù)庫對mNGS結果的影響：實驗室應驗證自建的數(shù)據(jù)庫中物種的準確性，過濾數(shù)據(jù)庫錯誤和不正確的序列，并定期更新數(shù)據(jù)庫；真菌和寄生蟲擁有龐大基因組，可與人類宿主讀長相混淆，并且可能低滴度存在于臨床標本中，給mNGS帶來挑戰(zhàn)。假陰性也可能是數(shù)據(jù)庫中缺少某物種所致（共識27）

7、mNGS檢測耐藥基因是一個挑戰(zhàn)，我們要注意首先需要定位耐藥基因來自哪個物種，耐藥基因位于質(zhì)粒上還是染色體上，背景微生物中也含有耐藥基因，有可能造成假陽性。另外要考慮質(zhì)?？梢栽诓煌N之間傳播，如果耐藥基因位于質(zhì)粒上，確定耐藥基因來自哪個物種比較困難

8、mNGS—性能驗證：對 mNGS整個檢測和分析流程進行性能驗證是其應用于臨床的瓶頸，建議對感染性疾病常見的“代表性”物種進行檢出限、包容性、抗干擾、精密度、攜帶和交叉污染、穩(wěn)定性等的驗證 。（共識28）

1、我們對mNGS既恨又愛，對于常規(guī)容易培養(yǎng)的病原菌的檢測，并非mNGS優(yōu)勢所在，mNGS在少見病原體、難培養(yǎng)或無法培養(yǎng)的病原體、新發(fā)病原體引起的感染方面有其優(yōu)勢。

2、mNGS步驟繁多，影響因素頗多，目前急需標準化。

3、mNGS結果解讀應結合患者臨床表現(xiàn)、其他微生物學檢測，由臨床感染病醫(yī)生、臨床微生物醫(yī)生（最好懂一些生信分析）共同去解讀結果。

4、在mNGS蓬勃發(fā)展的今天，傳統(tǒng)方法仍然不能放棄，相互印證。

正確解讀建立在合格的樣本的基礎上。解讀報告考慮如下參數(shù)：測序質(zhì)量（是否去除低復雜度、低質(zhì)量序列，Q20、 Q30 等）、讀長、特異性讀長、覆蓋率、深度、豐度、微生物序列的數(shù)據(jù)量、閾值等。要確定報告合格、可信。（共識29）

在mNGS 檢測報告中，建議結合不同標本類型與檢出病原微生物的種類進行解讀，區(qū)分無菌部位（血、無菌體液、組織、骨髓等）與正常有菌部位（如呼吸道、尿液、開放性傷口）。確認致病微生物時，應考慮檢出微生物是否為感染部位的潛在病原。如腦脊液檢出新型隱球菌，呼吸道標本檢出結核分枝桿菌、腺病毒（有些無癥狀兒童可能檢出腺病毒）、流感病毒，關節(jié)液或血液標本檢出布魯菌屬，均可認為是致病微生物。注意排除常見定植菌、污染菌與工程菌的影響。（共識30）

1、血漿樣本對cfDNA進行mNGS檢測時，建議從臨床的角度鑒別檢出序列屬于致病微生物、樣本污染、死亡微生物裂解，還是定植菌群所致的一過性菌血癥（共識31）。血液樣本檢出曲霉菌或其他真菌的游離DNA，并不意味著此類微生物入血，可能是游離的 DNA入血所致，和侵入性真菌感染有較大相關性。

2、注意感染診斷的多種方式，即關注新技術，也不忽視傳統(tǒng)方法，傳統(tǒng)與精準相結合：mNGS報告中常規(guī)容易培養(yǎng)的病原菌，建議臨床醫(yī)師結合傳統(tǒng)方法，綜合判斷其臨床價值（共識32）。建議對于在核酸提取過程中破壁困難的微生物，如分枝桿菌屬、諾卡菌屬、真菌（主要包括曲霉菌、毛霉菌、隱球菌屬與雙相真菌）等，即使在檢測報告中讀長數(shù)較低，也要考慮其為致病微生物的可能，并采用其他方法驗證，如特異引物的PCR 或一代測序等分子生物學檢測，G 試驗，GM 試驗，曲霉菌IgG抗體或隱球菌莢膜多糖抗原等血清學試驗（共識33）。mNGS對于新發(fā)或少見病原微生物的檢出具有重要價值。建議解讀報告單前應了解比對數(shù)據(jù)庫的內(nèi)容，明確其是否涵蓋少見病原或新發(fā)病原。檢出高致病性病原微生物，應及時與臨床聯(lián)系（共識35）。mNGS 結果為陰性，對于排除感染常具有較好的陰性預測值。但對于某些病原微生物，如結核分枝桿菌等，原始樣本中含量較少，或核酸提取困難的病原微生物，應考慮 mNGS 檢測靈敏度較低，陰性預測性差，并不一定優(yōu)于PCR等常規(guī)檢測方案（共識36）。

3、不能僅僅依靠讀長多少來判斷是否感染，建議同時考慮病原微生物種類差異與致病特性。同等條件下（相同微生物，相同標本），如某一微生物檢出的讀長數(shù)量多，為致病微生物的可能性大。但是，不同病原微生物基因組大小不同（寄生蟲>真菌>細菌>病毒），核酸提取效率存在差異［難易程度：病毒<革蘭陰性菌<革蘭陽性菌（不包括分枝桿菌、需氧放線菌等）<真菌］，致病力也相去甚遠（共識38）。建議各實驗室建立自己的閾值，并在臨床工作中加以驗證。（共識37）

4、 mNGS病原微生物檢測結果，建議由具有一定生物信息學知識，并從事臨床感染或臨床微生物等專業(yè)人員，結合患者臨床背景、影像學資料、其他的實驗室檢查結果，綜合判斷。不加以正確解讀與甄別，盲目依據(jù)mNGS報告開展治療，必將導至抗微生物藥物的濫用。（共識39）

最后強調(diào)，從事臨床感染與微生物的醫(yī)療人員應加深對臨床微生物與感染的認識，這樣才能夠更好的解釋mNGS報告，給患者帶來更多的益處。否則盲目使用mNGS 測序，會帶來更多問題。

作為一名ICU醫(yī)師，危重癥感染患者的救治是我們?nèi)粘９ぷ髦?。若患者發(fā)展成為膿毒癥或膿毒性休克，則死亡率可高達50%，尤其是以免疫抑制宿主包括風濕免疫性疾病，實體器官移植受體繼發(fā)感染為主要收治對象的機構。

最初我們對于NGS技術的理解主要有兩個：

1、可以檢測到通過常規(guī)培養(yǎng)方法無法分離出的病原體，因為在2016?2017年間如Film-Array，X-pert，或各種Pannel沒有像目前應用這么廣泛。其次需要注意的是，對于免疫抑制宿主，經(jīng)培養(yǎng)方法檢出的微生物未必一定是病原體，可以存在定植甚至污染的情況，但更重要的是，經(jīng)培養(yǎng)出的微生物未必是唯一病原體，比如在免疫抑制宿主中常見的病毒-真菌共感染情況，如：PJP+CMV，曲霉+CMV或PJP+曲霉等，利用NGS與傳統(tǒng)檢驗方法相結合，可以防止漏診。

2、對于感染患者，尤其是經(jīng)初始抗感染治療效果不佳轉(zhuǎn)為危重癥患者，通常會使用“廣覆蓋”的抗菌藥物使用策略，診治關鍵是需要明確是否為感染性疾病，感染的病原體是哪種。比如糖尿病患者發(fā)熱，咳嗽，肺部CT提示有空洞，GM試驗升高，首診醫(yī)師的第一印象可能會考慮是肺曲霉菌病，但未必，也有可能是ANCA相關性血管炎在肺內(nèi)的表現(xiàn)。那通過NGS檢測陰性的結果，當然是在覆蓋度比較廣的前提下，可以初步排除感染。當然，當初次NGS陰性，經(jīng)治療效果不佳仍考慮感染性疾病時，可以再次送檢。

所以NGS結合傳統(tǒng)的實驗室方法對于重癥感染患者的病原體檢測提供了很大的幫助。接下去的問題就是對于報告的解讀，有時報告提供的信息過少，比如告知有3個疑似可能的病原體，臨床醫(yī)生覺得已經(jīng)使用的抗菌藥物均可以覆蓋，但治療效果不好，可能會要求看這個測序的原始數(shù)據(jù)。另外就是給的信息很多，給臨床醫(yī)師帶來了很多的困惑，檢出的有可能的病原體都需要去覆蓋？另外就是對于檢出序列數(shù)的判斷，比如真菌。大家都知道真菌破壁困難，同樣感染的情況下，NGS真菌檢出的序列數(shù)相對較少，那么需要多少的序列數(shù)作為cutoff值可以使臨床啟動抗真菌治療，仍需要進一步探討。

所以，NGS結合常規(guī)檢驗技術對于臨床危重癥感染患者的病原體檢測提供了很大的幫助。臨床醫(yī)師需要了解基本的微生物和檢測知識，了解其檢測原理，根據(jù)宿主自身情況，結合實驗室檢查，影像學結果，NGS檢測和其他傳統(tǒng)的實驗室方法，綜合判斷。