目前，新冠疫情在全球席卷開來，對于如何確認(rèn)是否感染，使用體外診斷核酸檢測方法仍是不可或缺的手段。 體外診斷，是指在人體之外，通過對人體樣本(血液、體液、組織等)進(jìn)行檢測而獲取臨床診斷信息，進(jìn)而判斷疾病或機(jī)體功能的產(chǎn)品和服務(wù)。 而檢測人體樣本的關(guān)鍵步驟之一，即是樣本中的核酸（DNA和RNA）純化。核酸純化的方法是影響所提取核酸質(zhì)量的重要因素，只有高質(zhì)量的核酸才能滿足下游的各種應(yīng)用。 核酸是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)，而核酸提取是核酸檢測，乃至于整個分子行業(yè)繞不過去的門檻，很多時候一份樣本的核酸提取的好壞直接決定了檢測結(jié)果的有效性。 （一）核酸的基礎(chǔ)知識 核酸分為脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），其中RNA又可以根據(jù)功能的不同分為核糖體RNA(r RNA)，信使RNA（m RNA）和轉(zhuǎn)移RNA（t RNA）。 DNA主要集中在細(xì)胞核內(nèi)，線粒體和葉綠體中，而RNA主要分布在細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中。
（二） 為什么需要核酸提??？ 核酸提取為大量廣泛研究和應(yīng)用提供了答案（例如：克隆、qRT-PCR和全基因組、轉(zhuǎn)錄組范疇中的二代測序技術(shù)），獲得的核酸可以多種方式進(jìn)行應(yīng)用。 準(zhǔn)確的研究目的，決定了要提取的核酸類型；核酸的應(yīng)用往往影響提取方法的選擇。（例如：標(biāo)準(zhǔn)的End-point PCR反應(yīng)，不需要與全基因組測序?qū)嶒?yàn)相同的DNA質(zhì)量） 為了確定最佳的研究方法，有必要清楚了解核酸的下游應(yīng)用以及任何與樣品類型相關(guān)的潛在限制。（例如，臨床樣品采集量往往有限，核酸提取存在挑戰(zhàn)。） 雖然依據(jù)樣品類型，細(xì)胞裂解方式不同，但整體的核酸提取核心原則不變：細(xì)胞或組織樣品裂解，去除非核酸污染物（例如，蛋白質(zhì)等）。 （三）核酸提取純化原則和要求 1、保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性 2、排除其它分子的污染（如提取DNA時排除RNA的干擾） 3、核酸樣品中不存在對酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子； 4、其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降到最低程度； 5、排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子時應(yīng)去除RNA，反之亦然。 （四）常見核酸提取純化方法 1、苯酚氯仿抽提法 苯酚氯仿提取DNA是利用酚是蛋白質(zhì)的變性劑，反復(fù)抽提，使蛋白質(zhì)變性，SDS(十二烷基磺酸鈉)將細(xì)胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白質(zhì)或多肽或小肽分子，變性降解核蛋白，使DNA從核蛋白中游離出來。而DNA易溶于水，卻不溶于有機(jī)溶劑。蛋白質(zhì)分子表面帶有親水基團(tuán)，也容易進(jìn)行水合作用，并在表面形成一層水化層，使蛋白質(zhì)分子能順利地進(jìn)入到水溶液中形成穩(wěn)定的膠體溶液。當(dāng)有機(jī)溶液存在時，蛋白質(zhì)的這種膠體穩(wěn)定性遭到破壞，變性沉淀。離心后有機(jī)溶劑在試管底層(有機(jī)相)，DNA存在于上層水相中，蛋白質(zhì)則沉淀于兩相之間。利用萃取原理，根據(jù)蛋白核酸溶于不同的試劑層，將槍頭伸入不同液層內(nèi)抽取所需的成分，經(jīng)多次洗滌后獲得純化核酸。 缺點(diǎn)是由于使用了苯酚、氯仿等試劑，毒性較大，長時間操作對人員健康有較大影響，而且核酸的回收率較低，損失量較大，由于操作體系大，不同實(shí)驗(yàn)人員操作重復(fù)性差，不利于保護(hù)RNA，很難進(jìn)行微量化的操作。 優(yōu)點(diǎn)是采用了實(shí)驗(yàn)室常見的試劑和藥品，做起來成本比較低廉。 2、 離心柱純化 此種方法是利用核酸表面會覆蓋一層由水分子構(gòu)成的薄膜，在高鹽環(huán)境下，這層親水膜會遭到破壞從而核酸可被吸附在離心柱上，而其他雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物等則會被離心沉淀與核酸分離。最后通過洗脫，將核酸從吸附膜上脫離，即可得到純化后的核酸。離心柱純化也是的試劑盒提取中廣泛的使用方法。 但即便如此，離心柱純化法仍存在缺點(diǎn)： 高度依賴吸附膜的結(jié)合能力； 洗脫不完全導(dǎo)至核酸流失； 無法大量提取核酸。
3、磁珠法核酸分離技術(shù) 攜帶正電荷的磁珠易于吸附負(fù)電荷的核酸，主要用于從人血清或血漿樣品中提取DNA 和RNA（例如從血液樣本中檢測HIV 或HBV 病毒基因組的樣品制備）。一般而言，將樣品與結(jié)合緩沖液和磁珠混合，核酸與磁珠結(jié)合后，經(jīng)過數(shù)次洗滌與磁場捕獲，洗脫下來的核酸即可通過PCR 或其它特定方法來檢測特定的DNA或RNA。磁分離法也是廣泛應(yīng)用于診斷行業(yè)，且能實(shí)現(xiàn)高通量、自動化的核酸提取方法。
不同類型基因檢測均會涉及到核酸的提取和純化步驟。核酸提取純化的方法中，液體法和離心柱法均會涉及到有毒有機(jī)物的使用，對環(huán)境和實(shí)驗(yàn)操作者均存在一定的危害。而磁珠法需要相應(yīng)特殊配制的磁珠緩沖液和特異修飾后的磁珠，從成本和操作方面來分析，均存在成本高且操作步驟繁瑣，同時，也限制了自動化的進(jìn)程和應(yīng)用的推廣。因此，開發(fā)一種能快速釋放核酸并且對后續(xù)基因檢測實(shí)驗(yàn)無影響核酸快速釋放方法成為目前亟待解決的問題。 4、基因核酸快速釋放技術(shù) DNA釋放試劑盒，專用于從各種常見的樣品中快速釋放恒溫?zé)晒鈹U(kuò)增的 DNA，具有以下特點(diǎn)： 1. 核酸釋放劑可以快速裂解樣品，使樣品的 DNA 游離在溶液中。無需自備任何試劑，不使用苯酚、氯仿等有毒試劑。 2. 操作簡單，只用一步（約 3min）即可得到用于恒溫?zé)晒鈹U(kuò)增的 DNA 模板，不需要任何離心、抽提等操作步驟。 3. 全過程僅在一個離心管內(nèi)完成，避免微量樣品的損失，且不容易交叉污染，比常用的抽提試劑盒簡單，方便。 4. 兼容性廣，適用于常見的分子生物學(xué)樣品，包括細(xì)菌、昆蟲、各種動物組織、口腔細(xì)胞、毛發(fā)、組織中的細(xì)菌和病毒等。
應(yīng)用領(lǐng)域： 生命科學(xué)研究、分子診斷、動物疫情檢測、食品安全檢測、疾控/突發(fā)傳染病檢測、精準(zhǔn)用藥基因檢測 |
