臨床樣本中病原體檢測方法有很多，包括： 鑒定培養(yǎng)物中生長的微生物。 通過血清學實驗檢測特定微生物的生物標志物 通過分子生物學實驗進行單個或多重病原體特異核酸檢測。 這些方法雖然多,并且可以組合應用,對于常見高發(fā)感染也非常有效,但是它們都屬于試錯型,高度依賴于臨床醫(yī)生的判斷選擇。 目前在重癥感染病例的診斷上，試錯型嘗試病原體檢測耗時較長,臨床總體陽性率也比較低。臨床mNGS的技術特點是能夠大范圍甚至是全方位試錯,為臨床醫(yī)生提供了一個快速的檢測手段。但目前由于新技術的成本較高,且mNGS與宏轉(zhuǎn)錄組學測序( mtNGS)存在差異,導至臨床敏感度與預期相對較低,簡單地增加成本投人能有效提高臨床敏感度。此外，臨床mNGS除了測序生化反應外,還包含了病原體數(shù)據(jù)庫自動分析比對專家系統(tǒng),對于檢測結(jié)果的準確性也非常重要，故不是一個簡單的測序反應。一線工作人員，尤其是從事重癥病例治療的醫(yī)生，需要對mNGS的臨床應用有更多的了解,才能使mNGS更好地服務于臨床。 mNGS報告通過測序短序列的數(shù)量（reads）進行物種的鑒定,堿基序列片段數(shù)量越大，表明該物種在樣本中存在的可能性越高,但需要區(qū)分不同物種。同時需要考慮基因組的覆蓋度,覆蓋度與可信度呈正相關,但并非呈線性正相關。具體參考2019年的專家指南中mNGS檢測的專有名詞解釋。
陰性結(jié)果的解讀: mNGS報告中的信息是經(jīng)過特定閾值過濾后的結(jié)果,如果是陰性報告,首先需要分析患者的具體情況,再研究除報告外的原始檢測結(jié)果,判斷是因為未達到閾值誤判,還是確實不存在病原體。可以根據(jù)具體的臨床信息,在報告閾值之外考慮可能的原始檢出感染病原體,如胞內(nèi)感染菌。在陰性結(jié)果中，如果沒有進行RNA的宏基因組檢測(也稱為mtNGS),可能遺漏了以RNA為遺傳物質(zhì)的病毒,需進一步檢測宏轉(zhuǎn)錄組以明確病原體,如一種新型病毒性腦炎RNA病毒的發(fā)現(xiàn),否則存在假陰性的可能。對于某個臨床樣本，mNGS和mtNGS都為陰性的情況下,且內(nèi)參檢測值提示該樣本中單位體積內(nèi)(通常為1 mL)已知最小病毒小于10個分子時,可以考慮陰性價值,即患者不存在感染性疾病，可能存在免疫性疾病和腫瘤等。 陽性結(jié)果的解讀: 因不同部位臨床樣本的背景微生物存在差異,故陽性的判讀需要建立閾值才可以將真陽性的病原體從背景微生物中分離出來。這些閾值可以包含一些指標,如檢出特定微生物序列的數(shù)量、歸一化為每百萬序列的相對值、檢出微生物的基因組覆蓋度及內(nèi)參對照的檢出等情況。但需要在相同的測序平臺、相同的實驗室進行比較,以排除平臺和環(huán)境差異帶來的影響。而當某個鑒定達到陽性判斷閾值后,其增量與可靠性呈正相關,但并不呈線性相關,在未達到閾值時,其增量與鑒定可靠性呈指數(shù)正相關。因此,在判斷陽性時,達到閾值即可信。此外，在陽性報告中，如果有多種微生物大量存在，則應結(jié)合定植微生物考慮假陽性物種。而針對一些常見病原體,需考慮并增加耐藥基因的檢測，以提供更多的臨床治療指導方案。這里為常見的21種的病原體和32種抗生素。
非體內(nèi)正常定植菌的外來侵入性微生物在非感染部位出現(xiàn),一旦被檢出,即認為是病原體。 延遲陽性:有一些病原體由于被吞噬細胞吞噬,經(jīng)一段時間裂解釋放核酸后才能被檢出,需考慮多次送檢。 物種差異判讀:不同的病原體類型對應的閾值不同，應分類解讀。 病毒: 一些顯著區(qū)別于人基因組序列的病毒,如腺病毒和流感病毒等,有少量的特異序列檢出即可信,其閾值通常在3/100萬及以上即為可信;而一些與人源序列相似度高的病毒,如反轉(zhuǎn)錄病毒類,在檢出序列較少時，因無法判斷是否來自一些轉(zhuǎn)錄元件,只有更多序列檢出時才可信,其閾值通常需要超過1000/100萬,因為哪怕確實是某類反轉(zhuǎn)錄病毒，相對較少的檢出序列也更多指向其在人體內(nèi)是潛伏狀態(tài),而不是感染狀態(tài)。 真菌: 真菌的基因組較大,并且存在較厚的細胞壁,因此在核酸提取的效率上會大打折扣，即使進行了一些破壁處理,其檢出的特異序列數(shù)仍然不會很多,因此對于真菌的鑒定,其閾值考慮在5/100萬以上,在達到100/100萬以前,其可信度隨序列數(shù)增加而增加。 細菌: 對于一些細菌來說,要著重區(qū)分是定植菌、污染還是真正的病原菌。對于非胞內(nèi)感染菌,因不同細菌間存在同源相似性,菌種間可信閾值差異較大,并且因不同實驗室而有差異,因此鑒定報告應給出具體菌種的陽性參考閾值,并列出背景菌作為參考;而對于胞內(nèi)感染菌,如結(jié)核分枝桿菌和軍團菌的閾值相對較低,通常有1/100萬即可考慮可信,隨著序列數(shù)增加,其可信度逐漸增加,但達到30/100萬時,其增量不再有增加可信度的意義。 寄生蟲: 因為目前寄生蟲的基因組參考數(shù)據(jù)庫種類不多，且寄生蟲生物的多樣性,作為真核生物,有很多與人基因組相似的元件,因此在判斷陽性時要特別要求序列的特異性（唯一比對）。寄生蟲作為陽性判斷的閾值需在10/100萬以上，并且需要嚴格確認序列的特異性。 罕見病原體的陽性價值: 罕見病原體在報告中出現(xiàn)時,需要進一步確定其致病性及臨床特征,包括感染病灶的影像。罕見病原體的確認需要進一步調(diào)查患者病史,以確定其為動物疫源或者環(huán)境疫源的流行病學證據(jù)。 污染與定植: 在mNGS報告中,需要考慮取樣和樣本處理等環(huán)節(jié)帶來污染的可能性。例如:呼吸道肺泡灌洗液的樣本報告有大量的口腔菌,首先考慮取樣是否存在污染,其次考慮由于特殊原因造成的感染。但是如果存在非常多的背景微生物或者雜菌，且沒有1種或者幾種病原體占有主導量的優(yōu)勢，可以間接考慮患者免疫狀態(tài)嚴重破壞，需要引起治療和護理上的重視。 參考文獻： 李穎,麻錦敏.宏基因組學測序技術在中重癥感染中的臨床應用專家共識(第一版)[J].中華危重病急救醫(yī)學,2020,32(05):531-536. |
