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前言
前幾天和一位友人討論他的畢業(yè)課題，其主要目的是定量分析其代謝物在尿液中的暴露量，其它的代謝物均完成了定量分析，但在葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物的定量上遇到了一些困難，現(xiàn)就對其方法開發(fā)中需要注意的問題跟大家分享下：
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藥物的葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物有2個SAAG與SAG，為同分異構(gòu)體。代謝途徑與結(jié)構(gòu)式如下：（藥物不是水楊酸，SA只是其中的一個代謝產(chǎn)物）方法1：間接定量（酶解法），用葡萄糖醛酸酶水解后，對SA進行定量分析
①酶的來源，不同來源具有不同的酶解活性和最近工作PH
②酶解的環(huán)境，不同PH環(huán)境中，酶的活性不一樣
③酶解的時間，
④酶的濃度，酶加入量的多少，決定了酶解的完全程度
方法2：直接定量，分別直接對SAAG與SAG進行定量分析
①能夠分別買到SAAG與SAG的對照品，且對照品的純度足夠的高，不產(chǎn)生相互干擾
②SAAG與SAG因分子量一樣，需要色譜分離
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尿液中缺少蛋白質(zhì)和脂類(血漿中含6%~8%的蛋白質(zhì)),因此藥物容易與采集容器非特異性結(jié)合。
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大體積樣品需要更長的時間凍融，尿液樣品的凍融可能引起細胞碎片及鹽類的析出,導(dǎo)至樣品異質(zhì)化。
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放置過久細菌分解尿液成分可導(dǎo)至pH改變，或因尿中的碳酸氫鹽分解產(chǎn)生的二氧化碳會自然擴散到空氣中，使pH增高。
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水解和?；茡Q在·中性和堿性條件下更易發(fā)生。為了防止和減緩這個過程,生物樣品(血液、血漿、樣品提取物)通常應(yīng)在低溫下處理并保持在酸性條件。
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尿液具有輕微的酸性,使得其相對穩(wěn)定;但是尿液的pH常變化,這可能與其所含藥物和處理儲存的條件相關(guān)。在樣品的收集、儲存和處理中,保持尿液的酸度是至關(guān)重要的條件。
如何控制或減少代謝產(chǎn)物的內(nèi)源裂解：
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一般認為ESI應(yīng)優(yōu)先于大氣壓化學(xué)電離(APCI)，以減少內(nèi)源CID或化合物的熱分解
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ESI源的錐孔電壓參數(shù)與源溫度對源內(nèi)裂解起主要作用
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不同的加和離子，+NH4，以及負離子模式（-H），優(yōu)于正離子模式（+H）
生活中無處不在的水楊酸，因此可以預(yù)見體內(nèi)也含有其代謝產(chǎn)物SAAG與SAG
內(nèi)源性化合物是指體內(nèi)產(chǎn)生或飲食中含有的化合物。若內(nèi)源性化合物來源于食物：建議試驗前及試驗過程中嚴格控制該化合物自飲食攝入,統(tǒng)一標準化飲食。
在等分的生物基質(zhì)中加入已知的不同濃度的待測物,以加入待測物濃度和測得的響應(yīng)值做標準曲線,生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)的濃度可以由標準曲線的截距計算而得。方法原理簡單,有時可以排除基質(zhì)效應(yīng)的干擾;準確度會受到加入濃度的影響,本底濃度高、增量濃度相對較低時誤差較大。這種方法適用于定量下限高于5倍本底響應(yīng)的分析方法建立,現(xiàn)較少使用。
待測物的空白基質(zhì)很難獲取或空白基質(zhì)中本底確實很高,很多研究人員選用替代基質(zhì)用于分析方法的建立和驗證。替代基質(zhì)有很多種,最簡單的是水或緩沖液,如磷酸鹽緩沖液(PBS) ,也常在PBS中加入牛血清蛋白(BSA)或人血清蛋白(HSA),使其與生物基質(zhì)更相似。
選擇真實基質(zhì)中不存在的替代分析物配制標準曲線,當使用質(zhì)譜檢測器時,穩(wěn)定同位素標記物通常為最佳選擇。此時替代分析物和真實分析物之間僅存在相對分子質(zhì)量的差異,其他行為可視為一致。采用此法必須證明替代分析物與分析物在理化性質(zhì)、提取回收率、色譜保留和儀器響應(yīng)等性質(zhì)完全一致。在方法建立時要使用同濃度的2種分析物純?nèi)芤?/span>,考察兩者響應(yīng)關(guān)系。響應(yīng)因子為兩者的峰面積之比。許多因素如同位素標記不完全、純度不準確、氣相同位素交換、洗脫時間漂移等都會影響兩者間的響應(yīng)關(guān)系。因而建議在每個分析批前后考察兩者的響應(yīng)關(guān)系,調(diào)節(jié)碰撞能量使響應(yīng)因子維持在一個恒定值(±5% )寫完之后感覺這位友人畢業(yè)課題中的這一小部分內(nèi)容需考慮的問題還是蠻多的，希望他的實驗?zāi)苋缙谧鐾辏樌厴I(yè)。以上內(nèi)容純屬個人觀點，有考慮不全或說錯的地方，歡迎大家一起討論交流。
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