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十年深耘，優(yōu)化ALK融合基因檢測
國家癌癥中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院病理科JTO再發(fā)文
2020年11月26日胸部腫瘤學(xué)雜志(Journal of Thoracic Oncology,2019年影響因子13.357)在線發(fā)表了由我科分子室團(tuán)隊(duì)針對非小細(xì)胞肺癌ALK/ROS1/RET融合基因分子病理精準(zhǔn)檢測的文章（第一作者是李衛(wèi)華）。https://authors.elsevier.com/sd/article/S1556-0864(20)31023-6
間變性淋巴激酶（ALK）融合作為肺癌中最常見的融合類型，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。近年來針對它的TKI抑制劑已廣泛用于晚期非小細(xì)胞肺癌的臨床治療，顯著提高了ALK陽性患者的客觀緩解率并延長了無進(jìn)展生存期（PFS）。國家癌癥中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院病理科應(yīng)建明教授團(tuán)隊(duì)自2011年起即開始了對ALK融合基因分子檢測的相關(guān)研究。目前，針對ALK融合檢測的分子病理學(xué)方法有多種，主要包括熒光原位雜交（FISH）、免疫組化（IHC）、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和高通量測序（NGS），每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，如何在面臨不同人群、檢測樣本時(shí)選擇最優(yōu)的檢測平臺對ALK融合進(jìn)行精準(zhǔn)檢測，以達(dá)到精準(zhǔn)治療的臨床需求一直是我們的研究定位與追求。為此，本團(tuán)隊(duì)這十年來圍繞ALK基因融合的分子檢測優(yōu)化與規(guī)范化開展了一系列的研究，包括：（1）通過與FISH和RT-PCR比對，明確了Ventana IHC檢測ALK融合的可行性1，并在上千例大樣本肺癌人群中做了進(jìn)一步驗(yàn)證2，且將ALK檢測的應(yīng)用范圍由組織樣本推廣到細(xì)胞學(xué)樣本3；（2）利用IHC分析了ALK融合在肺癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶之間的異質(zhì)性4, 5、腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性6以及不同病理醫(yī)生判讀存在的差異7；（3）通過NGS探索了EML4-ALK融合患者接受TKI靶向治療后PFS存在差異的原因，明確了EML4-ALK不同亞型以及TP53伴隨突變對靶向治療療效的影響8, 9；（4）借助NGS發(fā)現(xiàn)了一些特殊ALK融合病例，包括FISH陰性IHC陽性的具有罕見融合伴侶的病例10, 11、基因間融合伴侶的病例等12，并聯(lián)合應(yīng)用其它平臺對其分子特點(diǎn)及對靶向治療的反應(yīng)進(jìn)行了深入分析。基于以上的研究，結(jié)合臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)及國內(nèi)外文獻(xiàn)，我們與我院腫瘤內(nèi)科王潔教授團(tuán)隊(duì)、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院病理科梁智勇教授團(tuán)隊(duì)牽頭，國內(nèi)多家醫(yī)院專家共同參與編寫了《中國非小細(xì)胞肺癌ALK檢測臨床實(shí)踐專家共識》13通過前期研究，我們發(fā)現(xiàn)基于DNA的雜交捕獲NGS（DNA NGS）雖然可以僅使用腫瘤基因組DNA就可同時(shí)對突變、融合和擴(kuò)增進(jìn)行檢測，但是其對融合的檢測存在一些缺陷，其中一條就表現(xiàn)在有些DNANGS檢出的ALK陽性的病例根據(jù)其DNA水平的融合斷點(diǎn)位置推測得出的RNA水平斷點(diǎn)與其真實(shí)的融合轉(zhuǎn)錄本斷點(diǎn)并不相符，但是哪些樣本會出現(xiàn)這種現(xiàn)象并不清楚。因此，我們對DNA NGS檢出的經(jīng)典EML4-ALK融合和罕見融合【包括非EML4-ALK融合（single non-EML4-ALK）及ALK相互融合（primary/reciprocal ALK）】進(jìn)行了RNA（靶向RNA NGS和全轉(zhuǎn)錄組測序）和蛋白（IHC）水平的確認(rèn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)典EML4-ALK融合DNA、RNA和蛋白水平具有高度一致性，且由DNA斷點(diǎn)推測得出的RNA斷點(diǎn)與RNA NGS測到的斷點(diǎn)位置相同。但是對于罕見融合，DNANGS陽性的病例中有一小部分（約10%）并沒有轉(zhuǎn)錄翻譯出融合蛋白（RNA NGS和IHC結(jié)果陰性），且此類患者靶向治療無效；剩下的罕見融合病例雖然能夠產(chǎn)生ALK融合轉(zhuǎn)錄本，但RNA NGS顯示其RNA水平的融合伴侶大多為EML4基因，而不是DNANGS所檢測到的罕見基因伴侶，而且所有的相互融合病例中的5‘ALK融合并沒有轉(zhuǎn)錄翻譯出融合蛋白。我們同時(shí)檢測了ROS1和RET融合，亦觀察到了相同的特點(diǎn)14。基于上述結(jié)果，本研究總結(jié)得出：（1）DNA NGS檢出的ALK罕見融合存在無法轉(zhuǎn)錄翻譯成有功能融合蛋白的可能性，如僅在DNA水平檢出融合的病例往往靶向治療無效；（2）隨著NGS的廣泛應(yīng)用，有越來越多的ALK罕見融合伴侶被發(fā)現(xiàn)（報(bào)道已多達(dá)上百種Ou IS-H, Zhu VW and Nagasaka M. Catalog of 5’ fusion partners in ALK-positive NSCLC circa 2020. JTO Clinical and Research Reports. 2020; 1: 1-10.），但實(shí)際上基于DNA NGS檢出的融合伴侶可能并不準(zhǔn)確，多數(shù)病例其真正的融合伴侶（RNA水平）仍為經(jīng)典的EML4基因，在真實(shí)世界中ALK的融合伴侶種類可能并不多；（3）DNA NGS檢出的相互融合其5’ALK不會產(chǎn)生有功能的融合蛋白。因此，如果臨床上僅依靠DNA NGS檢出的罕見ALK融合斷點(diǎn)來預(yù)測靶向治療的療效可能并不準(zhǔn)確，對此類罕見融合聯(lián)合應(yīng)用RNA/蛋白水平的檢測可能能夠更好地指導(dǎo)后續(xù)的精準(zhǔn)治療。1. Ying J, Guo L, Qiu T, et al. Diagnostic value of a novel fully automated immunochemistry assay for detection of ALK rearrangement in primary lung adenocarcinoma. Ann Oncol. 2013; 24: 2589-2593.2. Yang L, Ling Y, Guo L, et al. Detection of ALK translocation in non-small cell lung carcinoma (NSCLC) and its clinicopathological significance using the Ventana immunohistochemical staining method: a single-center large-scale investigation of 1, 504 Chinese Han patients. Chin J Cancer Res. 2016; 28: 495-502.3. Li W, Zhang Z, Guo L, Qiu T, Ling Y, Cao J, Guo H, Zhao H, Li L, Ying J. 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