本文章主要引用《體外診斷檢驗(yàn)系統(tǒng)性能評(píng)價(jià)方法第 3 部分：檢出限與定量限》征求意見稿中的數(shù)據(jù)進(jìn)行excel或常用軟件統(tǒng)計(jì)分析。同時(shí)參考《EP17-A2Evaluation-of-Detection-Capability-for-Clinical-Laboratory-Measurement-Procedures》進(jìn)行確認(rèn)。檢出限與定量限評(píng)估的重要性，從標(biāo)準(zhǔn)制定的意義可見一斑“在體外診斷試劑領(lǐng)域，臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的下限性能是非常關(guān)鍵的，尤其是當(dāng)分析物在低濃度水平有重要臨床意義時(shí)（如超敏肌鈣蛋白）。本標(biāo)準(zhǔn)旨在指導(dǎo)建立和驗(yàn)證臨床實(shí)驗(yàn)室定量測(cè)量程序的空白限、檢出限和定量限。用以解決產(chǎn)品研發(fā)、評(píng)審和應(yīng)用的全程控制寬松不一、質(zhì)量參差不齊的問題。對(duì)于體外診斷試劑質(zhì)量的統(tǒng)一管理和發(fā)展有著重要意義?！?/span>對(duì)于制造商，了解、掌握和應(yīng)用該標(biāo)準(zhǔn)可以提高IVD產(chǎn)品研發(fā)質(zhì)量，產(chǎn)品可靠性，增加注冊(cè)通過率，減少注冊(cè)發(fā)補(bǔ)，產(chǎn)品到客戶端后可保證用戶驗(yàn)證結(jié)果與聲稱性能具有一致性。
2.術(shù)語和定義
空白限limitof blank（ LoB）：空白樣本可能觀察到的最高測(cè)量結(jié)果。檢出限limitof detection (LoD)：由給定測(cè)量程序得到的測(cè)量值，對(duì)于此值，在給定聲稱物質(zhì)中存在某種成分的誤判率為α?xí)r，聲稱不存在該成分的誤判率為β。
（可從定義上簡(jiǎn)單理解，檢出限為能與空白限區(qū)分的最低分析物濃度）
定量限limitof quantitation (LoQ)：在規(guī)定條件下以指定的測(cè)量不確定度能測(cè)量的樣本中可被測(cè)量的最低量。三個(gè)指標(biāo)之間的關(guān)系：空白限<檢出限≤定量限三個(gè)指標(biāo)對(duì)應(yīng)的俗稱：空白限/檢出限→分析靈敏度；定量限→功能靈敏度，標(biāo)準(zhǔn)已不建議使用分析靈敏度和功能靈敏度來表述檢出能力。
3.總體要求
制造商在對(duì)體外診斷醫(yī)療器械進(jìn)行性能評(píng)價(jià)時(shí)，其計(jì)劃、實(shí)施、評(píng)價(jià)和文件化等相關(guān)過程應(yīng)符合YY/T 1441 的規(guī)定。制造商應(yīng)規(guī)定所有管理和實(shí)施體外診斷醫(yī)療器械性能評(píng)估相關(guān)人員的責(zé)任和相互關(guān)系，并確保具備充足的資源。制造商設(shè)計(jì)評(píng)價(jià)方案，并進(jìn)行測(cè)試，做好相關(guān)記錄，所有文件和記錄作為該產(chǎn)品技術(shù)文件的一部分。性能評(píng)價(jià)的負(fù)責(zé)人應(yīng)對(duì)性能評(píng)價(jià)結(jié)果最終評(píng)定和審查，并形成評(píng)價(jià)報(bào)告。（YY/T1441要求是ISO13485質(zhì)量管理體系中對(duì)性能評(píng)價(jià)的細(xì)化要求）嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，需要考慮分析天、分析批、試劑批號(hào)、校準(zhǔn)品批號(hào)、校準(zhǔn)周期、操作者、儀器、實(shí)驗(yàn)室等因素對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，采用平衡嵌套設(shè)計(jì)將各相關(guān)因素一起考慮。試驗(yàn)?zāi)Ｐ桶凑諛?biāo)準(zhǔn)要求，滿足試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭幸蟮拿總€(gè)樣本的最低測(cè)試數(shù)量，但在檢測(cè)天數(shù)、試劑批數(shù)、儀器系統(tǒng)方面可適當(dāng)調(diào)整。在每個(gè)分析批結(jié)束時(shí)，檢查測(cè)量結(jié)果，以便發(fā)現(xiàn)可能的處理錯(cuò)誤或結(jié)果缺失，通過格拉布斯（Grubbs）檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)離群值，允許剔除 1 個(gè)離群值，否則應(yīng)重新測(cè)定。
4.經(jīng)典方法建立空白限和檢出限
試驗(yàn)?zāi)康?/span>：使用經(jīng)典方法評(píng)價(jià)胃泌素釋放肽前體（proGRP）化學(xué)發(fā)光測(cè)量程序的空白限和檢出限。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)：采用1個(gè)儀器系統(tǒng)、2個(gè)試劑批、3小測(cè)試日、5個(gè)空白樣本、5個(gè)低濃度水平樣本、每個(gè)樣本進(jìn)行4次重復(fù)測(cè)量，滿足每個(gè)試劑批號(hào)的空白樣本與低濃度樣本測(cè)試結(jié)果數(shù)量≥60個(gè)。
正態(tài)性檢驗(yàn)的方法有圖形判定、偏度峰度分析，通過SPSS可以直接得出結(jié)果結(jié)論，以下為使用excel進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，計(jì)算峰度和偏度→計(jì)算相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)誤→計(jì)算Z分?jǐn)?shù)值→Z分?jǐn)?shù)值與Z(α)比較，當(dāng)α為0.05時(shí)，Z分?jǐn)?shù)在±1.96之間說明數(shù)據(jù)呈現(xiàn)正態(tài)分布。
由于空白樣本檢測(cè)結(jié)果不呈現(xiàn)正態(tài)分布，所以應(yīng)該采用非參數(shù)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以α為0.05，相應(yīng)的百分位數(shù)為1-0.05=0.95，空白檢測(cè)樣本例數(shù)為60，對(duì)應(yīng)的秩序?yàn)?0*0.95+0.5=57.5，5為非整數(shù)，采用線性插入法計(jì)算該秩序的結(jié)果，即空白限。
仍然以同樣空白樣本檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行參數(shù)法分析空白限，可以看出參數(shù)法（0.25pg/mL）和非參數(shù)法(0.176pg/mL)得出的結(jié)果差異很大，說明進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)得到正確統(tǒng)計(jì)結(jié)果的前提條件。
低值樣本檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)正態(tài)分布，以空白限0.25pg/mL為基礎(chǔ)，對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)低值樣本的結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析合并標(biāo)準(zhǔn)差和正態(tài)分布第95%的乘數(shù)。
5.精密度曲線法建立檢出限
當(dāng)假定檢出限（LoD）附近的變異很大，或者臨床實(shí)驗(yàn)室未對(duì)LoD進(jìn)行明確估計(jì)，期望獲得更寬測(cè)量濃度范圍的情形時(shí)，使用精密度曲線來建立LoD。對(duì)于制造商而言，LoD是未知的，主要使用該方法建立檢出限。
試驗(yàn)?zāi)康?/span>：使用精密度曲線法評(píng)價(jià)心肌標(biāo)志物檢測(cè)系統(tǒng)的檢出限。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)：1個(gè)儀器系統(tǒng)、2個(gè)試劑批、20個(gè)測(cè)試日、6個(gè)低濃度水平樣本、每個(gè)樣本每個(gè)試劑批每天重復(fù)測(cè)試4次。（本案例每個(gè)樣本的測(cè)試數(shù)量為80次，滿足每個(gè)樣本的測(cè)試數(shù)量大于等于40次也是可以的。）
統(tǒng)計(jì)方法：統(tǒng)計(jì)所有低值樣本檢測(cè)結(jié)果的均值和SD→根據(jù)均值和SD作散點(diǎn)圖和趨勢(shì)線確定擬合曲線→試驗(yàn)LoD等于被測(cè)量濃度時(shí)的值為L(zhǎng)oD→選擇兩批試劑中的較大值為L(zhǎng)oD
6.概率單位法建立檢出限
本方法主要應(yīng)用于分子診斷檢測(cè)系統(tǒng)評(píng)估檢出限。
試驗(yàn)?zāi)康?/span>：使用概率單位法評(píng)估細(xì)菌DNA分子檢測(cè)系統(tǒng)的檢出限。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)：使用三批試劑檢測(cè)5個(gè)梯度稀釋樣本，檢測(cè)32個(gè)重復(fù)，空白樣本用于確認(rèn)空白限，檢測(cè)22個(gè)重復(fù)?？瞻紫逓?。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果可能需要增加更多的梯度稀釋樣本進(jìn)行測(cè)試。
最初的5個(gè)梯度稀釋樣本僅有1個(gè)或2個(gè)非陰性樣本的陽性符合率小于1，不滿足建立概率模型要求。增加另外兩個(gè)低濃度樣本測(cè)試數(shù)據(jù)。
統(tǒng)計(jì)方法：使用probit概率單位分析法建立回歸模型→以95%的符合率計(jì)算對(duì)應(yīng)的濃度即為檢出限濃度。Probit回歸模型類似logistic回歸模型，使用logistic回歸模型得到的結(jié)果與probit接近。
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試劑批號(hào)
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Lot 1
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Lot 2
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Lot 3
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LoD (CFU/mL)
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0.064
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0.037
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0.037
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試劑批號(hào)
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Lot 1
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Lot 2
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Lot 3
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LoD (CFU/mL)
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0.077
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0.033
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0.031
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7.基于TE要求建立定量限
定量限（ LoQ）是指能夠準(zhǔn)確檢測(cè)到的樣本中分析物的最小實(shí)際量，其應(yīng)滿足實(shí)驗(yàn)室對(duì)準(zhǔn)確度的要求。定量限可以等于或高于檢出限，但不能低于檢出限。如果測(cè)量值的不確定度（或總誤差）偏低，則沒有必要對(duì)每一種方法都測(cè)定定量限。在這些情況下，可以適合地報(bào)告每一個(gè)低水平結(jié)果的估計(jì)不確定度，并允許用戶指出是否適用。LoQ 優(yōu)選根據(jù)總誤差目標(biāo)或偏倚目標(biāo)來定義。
試驗(yàn)?zāi)康?/span>：基于TE要求建立cTnI測(cè)量程序的定量限。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)：1個(gè)儀器系統(tǒng)、2個(gè)試劑批、3個(gè)測(cè)試日、5個(gè)低濃度水平樣本，每個(gè)樣本進(jìn)行4次重復(fù)測(cè)量。LoQ準(zhǔn)確度目標(biāo)是小于20%的總誤差（TE）。使用傳統(tǒng)westgard模型定義該評(píng)估的TE=bias絕對(duì)值＋2s。
統(tǒng)計(jì)方法：使用確定值和TE(%)進(jìn)行線性擬合，將20%的TE目標(biāo)值代入擬合方程，得到對(duì)應(yīng)的值是38.98，預(yù)估定量限在40pg/mL附近。在濃度40pg/mL左右制備5個(gè)混合樣本，使用參考方法定值。試驗(yàn)?zāi)Ｐ团c初始5個(gè)濃度測(cè)試方案類似，重復(fù)數(shù)由4次可減少為3次。
對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)TE%,每個(gè)試劑樣本計(jì)算的TE%均滿足≤20%的準(zhǔn)確度目標(biāo)，因此認(rèn)為滿足LoQ標(biāo)準(zhǔn)。滿足試劑批次1的準(zhǔn)確度目標(biāo)的最低樣本濃度為31.90pg/mL。對(duì)于試劑批次2，LoQ為30.30pg/mL。這兩個(gè)估計(jì)值中較大值31.90pg/mL報(bào)告為測(cè)量程序的LoQ。
8.利用精密度曲線建立定量限
試驗(yàn)?zāi)康?/span>：基于精密度要求建立促卵泡生成激素（FSH）化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)系統(tǒng)的定量限。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)：1個(gè)儀器系統(tǒng)、2個(gè)試劑批、5個(gè)測(cè)試日、9個(gè)低濃度水平樣本，每個(gè)樣本進(jìn)行8次重復(fù)測(cè)量，上午、下午各4次。
統(tǒng)計(jì)方法：統(tǒng)計(jì)9個(gè)低濃度水平樣本檢測(cè)數(shù)據(jù)的均值、標(biāo)準(zhǔn)差、CV值→采用origin軟件對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合（使用excel同樣可以，添加趨勢(shì)線中選擇冪函數(shù)），將變異系數(shù)CV%定義為自變量（X），均值定義為因變量（Y），依據(jù)數(shù)據(jù)組的曲線走勢(shì)，選擇冪函數(shù)進(jìn)行擬合，將期望的精密度水平10%代入擬合方程，得到的濃度為定量限，選擇兩批試劑中定量限值大的報(bào)告為檢測(cè)系統(tǒng)最終的定量限。
9.空白限和檢出限驗(yàn)證方法
空白限和檢出限的驗(yàn)證方法，適用于用戶實(shí)驗(yàn)室使用，同時(shí)也適用于制造商的研發(fā)質(zhì)量監(jiān)督部門或是產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)部門。試驗(yàn)?zāi)康?/span>：驗(yàn)證胃泌素釋放肽（proGRP）化學(xué)發(fā)光測(cè)量程序，聲稱的空白限（LoB）0.25pg/mL，檢出限為（LoD）0.36pg/mL，誤差風(fēng)險(xiǎn)α=β=0.05的檢測(cè)能力是否符合聲明。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)：1個(gè)儀器系統(tǒng)、1個(gè)試劑批、3個(gè)測(cè)試日、2個(gè)空白樣本、2個(gè)低濃度水平樣本、每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)試4次。
統(tǒng)計(jì)方法：計(jì)算空白樣本檢測(cè)結(jié)果大于空白限的比例，低濃度樣本小于空白限的比例是否大于同樣本量對(duì)應(yīng)的百分比要求。
9.定量限驗(yàn)證方法
定量限的驗(yàn)證方法，適用于用戶實(shí)驗(yàn)室使用，同時(shí)也適用于制造商的研發(fā)質(zhì)量監(jiān)督部門或是產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)部門。試驗(yàn)?zāi)康?/span>：驗(yàn)證胃泌素釋放肽（proGRP）化學(xué)發(fā)光測(cè)量程序，聲稱的空白限（LoD）1.05pg/mL，誤差風(fēng)險(xiǎn)α=β=0.05的檢測(cè)能力是否符合聲明。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)：1個(gè)儀器系統(tǒng)、1個(gè)試劑批、3個(gè)測(cè)試日、5個(gè)低濃度水平樣本、每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)試3次。
統(tǒng)計(jì)方法：將低值樣本的檢測(cè)結(jié)果與各自允許的TE范圍限值進(jìn)行比較，計(jì)算落在范圍外的結(jié)果數(shù)量和百分比，當(dāng)在范圍內(nèi)的結(jié)果百分比大于88%（45個(gè)測(cè)試結(jié)果要求最小百分比）時(shí)，LoQ聲明驗(yàn)證通過。計(jì)算簡(jiǎn)單同空白限和檢出限一致，主要計(jì)算百分比，這里就不放操作動(dòng)圖了。
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