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側(cè)流免疫層析（lateral flow immunochromatography assay，LFIA）是一種基于抗原、抗體免疫反應(yīng)的經(jīng)典床旁檢測(cè)技術(shù)（point of care testing，POCT）。最初，研究人員采用納米金制備層析試紙條，用于尿人絨毛膜促性腺激素檢測(cè)，即我們熟知的膠體金。但檢測(cè)結(jié)果依賴(lài)人工判讀，且檢測(cè)靈敏度低、假陰性率高。隨后，一些對(duì)層析膜進(jìn)行簡(jiǎn)單圖像采集、處理的儀器相繼出現(xiàn)，LFIA結(jié)果判讀實(shí)現(xiàn)自動(dòng)、半定量化。
近年來(lái)，LFIA不斷發(fā)展，檢測(cè)性能得到很大提升，已逐步向定量檢測(cè)過(guò)渡，其可檢測(cè)樣品多樣（如全血、血漿、汗液、唾液，尿液等），并且能對(duì)核酸進(jìn)行檢測(cè)[1]。本文綜述了LFIA檢測(cè)系統(tǒng)的研究進(jìn)展以及LFIA的商品化應(yīng)用現(xiàn)狀，以期為相關(guān)領(lǐng)域提供參考。
一、LFIA結(jié)構(gòu)及定量檢測(cè)
側(cè)流免疫層析試紙條由樣品墊、結(jié)合墊、層析膜、吸水紙和聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）底板五部分組成。單克隆抗體和二抗被預(yù)先固定在層析膜上以形成測(cè)試線或?qū)φ站€，加入含待測(cè)物的樣品后，待測(cè)物與結(jié)合墊上的標(biāo)記抗體結(jié)合，隨層析作用進(jìn)一步被固定在T線上的單抗捕獲。過(guò)量的標(biāo)記抗體被C線上的二抗捕獲，通過(guò)特定檢測(cè)儀器讀取T/C線上的標(biāo)記物信號(hào)強(qiáng)度，并代入預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在保留LFIA優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)實(shí)現(xiàn)了LFIA對(duì)待測(cè)物的定量分析[2]。對(duì)于完整的LFIA定量檢測(cè)系統(tǒng)而言，標(biāo)記物、層析膜、檢測(cè)儀是保障定量結(jié)果快速、靈敏、準(zhǔn)確的基礎(chǔ)。在近十年里，已研發(fā)出不同信號(hào)類(lèi)型的靈敏標(biāo)記物以及多種新型層析膜材料，還設(shè)計(jì)了一系列價(jià)格合理、結(jié)構(gòu)緊湊的檢測(cè)設(shè)備用于免疫層析結(jié)果的記錄和量化。特別地，為保證定量結(jié)果溯源性，對(duì)試驗(yàn)中所使用的標(biāo)記物、耗材、試劑、儀器及檢測(cè)程序均可開(kāi)展量值溯源工作，以使LFIA產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果溯源至國(guó)家或國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)?？捎媒?jīng)典的蛋白和分子檢測(cè)方法，作為驗(yàn)證LFIA診斷效能的參比方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）等[3]。LFIA實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)使得檢測(cè)結(jié)果不受主觀因素制約，大大提高了其在即時(shí)檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用深度與廣度。下文就實(shí)現(xiàn)LFIA定量檢測(cè)的三個(gè)重要組成部件即標(biāo)記物、檢測(cè)儀器、層析膜以及取得的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行詳細(xì)闡述。
二、LFIA檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)展
納米標(biāo)記物的成功應(yīng)用使LFIA邁向定量檢測(cè)的新臺(tái)階，根據(jù)標(biāo)記物產(chǎn)生的信號(hào)不同，將其大致分為三類(lèi)：（1）有色型標(biāo)記物：會(huì)產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的顏色；（2）熒光型標(biāo)記物：在特定光源激發(fā)下可產(chǎn)生熒光；（3）其他標(biāo)記物：包括納米酶、磁珠等，分別產(chǎn)生酶學(xué)信號(hào)、磁信號(hào)。
納米金（aurum nanoparticles，AuNPs）在水溶液中由于表面靜電作用呈膠體狀態(tài)，具有優(yōu)異的理化性質(zhì)且易于功能化，是LFIA中最常用的標(biāo)記物。但AuNPs存在粒徑分布寬、穩(wěn)定性差、儲(chǔ)存條件高的不足。近年來(lái)，已有研究采用油相合成、化學(xué)鍵合等方法來(lái)對(duì)AuNPs進(jìn)行增強(qiáng)、組裝、聚合，如二維黑磷[4]，改良后的AuNPs既保留了原有特性，穩(wěn)定性又得到很大提升，在微量藥物、病毒糖蛋白的定量檢測(cè)中，顯示出廣闊的應(yīng)用前景。碳納米管（carbon nanotubes，CNTs）是由石墨烯片組成的無(wú)縫空心管狀體，具有高比表面積、良好的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)惰性。另外，自身黑色使AuNPs具有很強(qiáng)的辨識(shí)度，因此CNTs的靈敏度比AuNPs更高。但CNTs易于聚集，幾乎不溶于任何有機(jī)溶劑。在CNTs表面添加親水性的共價(jià)官能團(tuán)，可改善CNTs的溶解性局限，并獲得更好的穩(wěn)定性，尤其適用于小分子化合物和特定蛋白的定量檢測(cè)[5]。
由于有色型標(biāo)記物信號(hào)放大能力有限，現(xiàn)已將許多新型熒光材料用于LFIA的定量檢測(cè)，常用的熒光標(biāo)記物有量子點(diǎn)、鑭系元素等。量子點(diǎn)（quantum dot，QD）是一種半導(dǎo)體熒光納米晶體，熒光強(qiáng)度大且穩(wěn)定，其發(fā)光光譜可調(diào)、狹窄、對(duì)稱(chēng)，適用于微量物質(zhì)的檢測(cè)。單一的QD經(jīng)過(guò)兩親聚合物修飾后，可制備成核殼型量子點(diǎn)，其穩(wěn)定性更好、保存期更長(zhǎng)。在腫瘤標(biāo)志物和小分子藥物的檢測(cè)中，檢測(cè)限（limit of detection，LOD）可低至5.8 ng/ml。以QD為標(biāo)記物的LFIA，還適用于熒光猝滅的方法，較其他標(biāo)記物具有更寬的線性范圍，在感染性疾病診斷、腫瘤診斷試劑開(kāi)發(fā)和藥物監(jiān)測(cè)領(lǐng)域前景可觀[6]。鑭系元素（lanthanide elements，LE）具有原子態(tài)發(fā)射、長(zhǎng)熒光壽命、窄發(fā)射光譜、寬斯托克斯位移的特性，常用作基于時(shí)間分辨的免疫分析，在小分子藥物檢測(cè)中，表現(xiàn)出良好的重復(fù)性，LOD比最靈敏的AuNPs低約100倍。但LE在水溶液中存在低熒光產(chǎn)量的缺陷，可將LE與納米微球等載體結(jié)合，以增加熒光產(chǎn)量[7]。上轉(zhuǎn)發(fā)光粒子（up-converting phosphor，UCP）是由稀土金屬元素合成的晶體材料，和其他標(biāo)記物相比，UCP具有獨(dú)特的上轉(zhuǎn)發(fā)光現(xiàn)象、低背景干擾和高穩(wěn)定性，非常適合于檢測(cè)成分復(fù)雜的樣品，如尿液、唾液等。檢測(cè)結(jié)果與培養(yǎng)法和PCR法高度一致，可在20 min內(nèi)檢測(cè)10種食源性致病菌[8]。熒光微球（fluorescent microsphere，F(xiàn)MS）通常由納米微球包裹熒光材料或在其表面偶聯(lián)熒光物質(zhì)制備而成，具有良好的親和性和高比表面積，目前已經(jīng)制備出包含有機(jī)染料、QD、UCP等熒光材料的FMS。但FMS合成步驟復(fù)雜、產(chǎn)率低、成本高，僅在生物酶、小分子藥物的檢測(cè)中有研究報(bào)道[9]。
拉曼散射（raman scattering，RS）指熒光物質(zhì)的吸收光與發(fā)射光不等的現(xiàn)象，不同物質(zhì)的拉曼散射不同，將拉曼分子與金屬表面接觸后可實(shí)現(xiàn)拉曼信號(hào)的放大，即表面增強(qiáng)拉曼散射（surface enhanced raman scattering，SERS），SERS信號(hào)穩(wěn)定、靈敏，可用于多重檢測(cè)生物大分子蛋白、病毒、細(xì)菌，但對(duì)特殊檢測(cè)儀器的依賴(lài)，使得SERS在實(shí)際應(yīng)用中并不廣泛[3]。超順磁珠是具有磁性?xún)?nèi)核和活性基團(tuán)表面的復(fù)合納米材料，具有易分離、信號(hào)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，其結(jié)果不受樣品中有色成分的影響，在微量激素、腫瘤標(biāo)志物、藥物檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用前景，但超順磁珠需要磁檢測(cè)器或巨磁阻傳感器，在一定程度上限制了其應(yīng)用[10]。納米酶是一類(lèi)具有多孔結(jié)構(gòu)的雙金屬納米粒子，具有高比表面積和特殊的酶催化性能，但納米酶合成困難、需額外的顯色步驟。與膠體金相比，納米酶靈敏度提高了兩個(gè)數(shù)量級(jí)，其LOD和線性范圍與商業(yè)ELISA試劑盒相當(dāng)[11]。
針對(duì)不同標(biāo)記物信號(hào)，需用不同的檢測(cè)儀器。早期的免疫層析檢測(cè)儀主要針對(duì)AuNPs設(shè)計(jì)，大多將T/C線的顏色信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)或灰度圖像，如光敏電阻法、圖像處理法等，由于T/C線的寬度較窄，光敏電阻法的信號(hào)響應(yīng)受到限制；圖像處理法也存在對(duì)灰度圖像的利用不充分的缺點(diǎn)?，F(xiàn)已報(bào)道了多種新型金標(biāo)檢測(cè)儀，如光熱成像分析儀、壓力讀數(shù)儀[4,12]，通過(guò)分析儀檢測(cè)T/C線溫度、氣壓變化，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的數(shù)字轉(zhuǎn)換就可以得到定量檢測(cè)結(jié)果，靈敏度比光敏電阻法高68倍，有望應(yīng)用于生物大分子檢測(cè)。
隨著熒光標(biāo)記物的廣泛使用，其配套的熒光檢測(cè)儀也在不斷的更新發(fā)展，為L(zhǎng)FIA的檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確和定量的工具，不僅具有量化和客觀解釋結(jié)果的優(yōu)勢(shì)，還可以自動(dòng)存檔和傳輸結(jié)果?，F(xiàn)有的熒光檢測(cè)儀主要有直接檢測(cè)熒光強(qiáng)度和智能手機(jī)兩種模式。直接檢測(cè)熒光強(qiáng)度：通過(guò)光電探測(cè)器從T/C線中獲取背景和熒光信號(hào)并轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，是上述熒光標(biāo)記物信號(hào)檢測(cè)的主要方式，在大型醫(yī)院中有廣泛應(yīng)用，但這種模式需要完整的機(jī)電、發(fā)射及檢測(cè)系統(tǒng)，使得整套儀器笨重、復(fù)雜，不利于便攜化和即時(shí)診斷。智能手機(jī)：采用智能手機(jī)自帶的閃光燈和相機(jī)，可對(duì)熒光及化學(xué)發(fā)光信號(hào)進(jìn)行激發(fā)和檢測(cè)，使智能手機(jī)成為便攜檢測(cè)儀的新可能。You等[13]利用智能手機(jī)作為L(zhǎng)FIA的檢測(cè)器，配合相應(yīng)的軟件系統(tǒng)，可同時(shí)定量檢測(cè)腦利鈉肽與致瘤性2因子，LOD分別為17.46 pg/ml和29.92 ng/ml?，F(xiàn)有的智能手機(jī)檢測(cè)器具有良好的不同信號(hào)辨識(shí)度和檢測(cè)微弱T/C線信號(hào)的能力，在疾病的家庭自檢中具有極大的應(yīng)用前景。層析膜是進(jìn)行層析作用的主要部件，對(duì)于保證免疫反應(yīng)進(jìn)行和實(shí)現(xiàn)多組分檢測(cè)至關(guān)重要。膜背景發(fā)光、孔徑大小及分析物通過(guò)膜的液體流速既是評(píng)價(jià)膜性能好壞的重要指標(biāo)，也是研發(fā)膜材料的切入點(diǎn)。
大多數(shù)商用層析膜在可見(jiàn)光區(qū)域會(huì)產(chǎn)生明顯的背景發(fā)光，其常見(jiàn)原因包括自發(fā)熒光、磷光和拉曼散射。在進(jìn)行LFIA分析前，如何選擇低背景發(fā)光的層析膜，是需解決的首要問(wèn)題。Shah和Yager[14]應(yīng)用激發(fā)-發(fā)射熒光光譜來(lái)系統(tǒng)地表征膜材料的自發(fā)熒光，并評(píng)估背景發(fā)光對(duì)分析性能的影響。為開(kāi)發(fā)人員篩選低背景發(fā)光層析膜提供了一個(gè)簡(jiǎn)單的框架，使用該框架可減少耗時(shí)的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化過(guò)程，在對(duì)甲型流感病毒核蛋白檢測(cè)中，LOD較未使用該框架前降低50%以上。
現(xiàn)有的LFIA層析膜具有更少的背景干擾、更好的穩(wěn)定性和樣品利用率。已有多種膜材料通過(guò)改變層析膜的孔徑來(lái)控制液體流速，從而提高LFIA分析靈敏度。如水凝膠-紙雜化材料可以增加待測(cè)物的反應(yīng)時(shí)間；海綿具有良好的層析作用和親水性；納米纖維材料具有高比表面積、高孔隙率、互連的多孔網(wǎng)絡(luò)和靈活的可修飾性。Yew等[15]在NC膜上噴涂聚己內(nèi)酯形成疏水涂層，以提高靶標(biāo)與金納米顆粒之間的相互作用率，靈敏度提高了大約十倍。另外，在進(jìn)行全血樣品分析時(shí)，可將層析膜與分離裝置結(jié)合，以減少紅細(xì)胞的空間位阻對(duì)待測(cè)物在膜上的流動(dòng)造成的影響[16]。
三、LFIA在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用
目前大多數(shù)LFIA使用抗體作為靶標(biāo)識(shí)別元件，但抗體的使用存在一些局限，如抗體成本高、熱穩(wěn)定性差、易受pH影響。由于適配體易于修飾且具有高特異性、穩(wěn)定性，已有研究將適配體作為抗體的替代物用于LFIA，實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸、蛋白質(zhì)、小分子化合物的靈敏檢測(cè)。與基于抗體的LFIA相比，適配體具有更高的靈敏度，適用于藥物分析、疾病預(yù)防和靶向治療領(lǐng)域[17]。同時(shí)，基于適配體的LFIA存在一些不足：適配體由指數(shù)富集獲得，過(guò)程較復(fù)雜，價(jià)格昂貴；易受到鉤效應(yīng)影響，造成假陰性結(jié)果；可用的適配體性有限，與免疫測(cè)定相比，基于適配體的檢測(cè)仍不成熟[18]。
特異性核酸序列檢測(cè)在醫(yī)學(xué)診斷、食品安全分析和環(huán)境監(jiān)測(cè)中具有重要作用。近年來(lái)，結(jié)合了LFIA與核酸檢測(cè)的側(cè)流核酸生物傳感器（lateral flow nucleic acid biosensor，LFNAB）在生物分析和臨床診斷中的應(yīng)用顯著增加，具有操作簡(jiǎn)單、不需要復(fù)雜的分析過(guò)程和特殊儀器的特點(diǎn)，成為POCT核酸分子診斷的新技術(shù)。利用LFNAB進(jìn)行核酸檢測(cè)，通常需進(jìn)行兩個(gè)步驟，即靶分子擴(kuò)增過(guò)程和試紙條層析過(guò)程，層析過(guò)程大多采用基于生物素-親和素的夾心雜交法[19]。結(jié)合現(xiàn)有的等溫?cái)U(kuò)增方法（如環(huán)介導(dǎo)的擴(kuò)增）和信號(hào)放大法（熒光分析，電化學(xué)分析）可簡(jiǎn)化擴(kuò)增過(guò)程、增加信號(hào)強(qiáng)度，使LFNAB具備了檢測(cè)時(shí)間短、成本效益高的優(yōu)點(diǎn)。Pavagada等[20]提出了一種無(wú)需擴(kuò)增步驟直接檢測(cè)內(nèi)源性miR-150-5p濃度的LFIA方法，為L(zhǎng)FNAB提供了新方向。LFNAB目前已實(shí)現(xiàn)對(duì)脫氧核糖核酸、16S核糖體核糖核酸、微小核糖核酸等核酸分子的快速、多重檢測(cè)。但由于探針序列普遍較短，容易造成假陽(yáng)性；夾心雜交法的設(shè)計(jì)、構(gòu)造過(guò)程復(fù)雜，LFNAB的整體性能還有待提高。
為明確LFIA的實(shí)際商品化應(yīng)用情況，在國(guó)家藥品監(jiān)督管理局官網(wǎng)進(jìn)行國(guó)家醫(yī)療器械許可查詢(xún)，以"免疫層析"為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，結(jié)果顯示用于免疫層析的醫(yī)療器械共計(jì)1 249種，其中檢測(cè)儀器43種（膠體金定量檢測(cè)儀31種，熒光免疫層析儀12種），試劑盒1 206種（包含811種定量檢測(cè)試劑盒，395種定性檢測(cè)試劑盒）。在定量檢測(cè)試劑盒中膠體金試劑盒共288種；熒光免疫試劑盒共514種；金磁免疫試劑盒共9種。另外，定量檢測(cè)試劑盒可完成78個(gè)項(xiàng)目檢測(cè)，包含炎性指標(biāo)、腫瘤標(biāo)志物、酶、激素等，其中有291種試劑盒可完成心肌損傷標(biāo)志物的定量檢測(cè)，225種試劑盒可完成炎癥因子的定量檢測(cè)。現(xiàn)有的定量免疫層析試劑盒數(shù)量為定性試劑盒的2.1倍，熒光定量試劑盒數(shù)量是膠體金定量試劑盒的1.8倍，反映出LFIA正由傳統(tǒng)的定性檢測(cè)向定量檢測(cè)轉(zhuǎn)變，并且更多使用熒光標(biāo)記物。另外，炎性指標(biāo)和心肌損傷標(biāo)志物遠(yuǎn)多于其他檢測(cè)項(xiàng)目，因?yàn)檫@二者在疾病早期就可出現(xiàn)，并且疾病發(fā)病較急，說(shuō)明檢測(cè)項(xiàng)目設(shè)置更偏向?qū)嵱眯詮?qiáng)、臨床意義大的指標(biāo)。
隨著LFIA檢測(cè)系統(tǒng)的改進(jìn)與提升，其檢測(cè)靈敏度不斷提高，在疾病診斷、藥物監(jiān)測(cè)、食品安全等方面的應(yīng)用愈加廣泛。靈敏標(biāo)記物的使用，顯著放大了LFIA的檢測(cè)信號(hào)；基于便攜設(shè)備（如智能手機(jī)）的檢測(cè)儀已研發(fā)成功，使LFIA的家用化成為可能；新型層析膜可有效減少背景熒光，使結(jié)果更加準(zhǔn)確。實(shí)際應(yīng)用中LFIA開(kāi)始轉(zhuǎn)向定量檢測(cè)，包括核酸檢測(cè)，使LFIA成為待測(cè)物分析的有效、精準(zhǔn)、可信方法。相信不久，隨著檢測(cè)儀器的發(fā)展，層析膜材料的更新，更多靈敏標(biāo)記物的應(yīng)用，LFIA檢測(cè)項(xiàng)目會(huì)更多、更普及；其操作方式會(huì)更加智能、便攜、家用；定量結(jié)果輸出也會(huì)更加快速、靈敏、準(zhǔn)確。
選自中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2019,43(06)
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